实时定量PCR的原理、探测化学物质及探针优化(一)

1. 实时PCR原理

对扩增产物进行可重复性的定量长期以来一直是科学家和研究者的目标。传统的方法需要对终产物进行凝胶电泳分析。这种方法可以确定目的产物和竞争产物的大小，估算纯度，计算条带强度。然而，所用扩增试剂和体系的变动会造成扩增的终产物的重复性有较大的变动，成为这种方法的主要弊端。

扩增过程的指数期提供给我们最有用的，可重复的数据。在起始的目的DNA量与循环过程的指数期的扩增产物量之间存在着定量关系。这正是实时扩增的基础。随着DNA内嵌染料和探针特异性化学的发展，实时探测量子学的跳跃发展推动了对扩增过程的研究进展。

今天的实时设备由荧光读数计和热循环仪组成，用来监测循环过程的荧光。与实时设备相连的计算机收集荧光数据。数据通过开发的实时分析软件以图表的形式显示。

原始数据被绘制成荧光强度相对于循环数的图表。

在扩增的每个循环中至少收集一次荧光数据来进行扩增的实时监控。用户能够根据一个一个的循环知道那个样品正在扩增。这些即时的数据允许用户看清楚各个样本相对于标准品，阳性对照和阴性对照是如何扩增的。用户不仅能在扩增过程中监督整个反应，还可以根据反馈的信息来优化相应程序。因此增加了敏感性，特异性和有效性。

正常化后的数据画成荧光值相对于循环数的对数图。

原始数据收集后可以开始分析。实时设备的软件能使收集到的数据进行正常化处理来弥补背景荧光的差异。正常化后可以设定域值水平，这就是分析荧光数据的水平。

样品到达域值水平所经历的循环数称为Ct值（限制点的循环数）。域值应设定在使指数期的扩增效率为最大，这样可以获得最准确，可重复性的数据。如果同时扩增的还有标有相应浓度的标准品，线性回归分析将产生一条标准曲线，可以用来计算未知样品的浓度。

2. 探测化学物质

有5种主要类型的探测化学物质用于实时扩增，包括：

2.1 内嵌染料
2.2 双标记探针
2.3 FRET探针
2.4 分子信标
2.5 Ampliflor

2.1内嵌染料（Sybr-Green I ）

内嵌染料，例如Sybr-Green I ，能与双链DNA结合

a） SG不与单链DNA结合，荧光信号强度较低

b） SG与双链DNA结合，荧光信号强度极大的增强

SG是一种荧光染料，能结合到DNA双螺旋的小沟。处于溶解状态的未结合染料显示低 的荧光强度，一旦结合到双链DNA之后荧光信号增强。这种特性被利用在实时扩增中。由于 在扩增反应中DNA增加，染料结合到扩增产物上，荧光信号增强。

荧光信号相对背景水平的 增加进行分析。根据扩增子的长度有多个荧光染料的分子结合到双链DNA上。内嵌染料可以 所有其他传统扩增成分，例如水，缓冲液，MgCl2，dNTPs，Taq-聚合酶，引物和模板一起加到扩增反应管中。因为不需要设计序列特异性探针和新的引物对，这种方法是一种简便 ，性价比较高的实时监测方法。

内嵌染料没有序列特异性，可以结合到包括非特异产物和引物二聚体在内的任何dsDNA上，因此有必要区分目标信号和假信号。

内嵌染料可以在反应末尾对扩增产物进行溶解，称为溶解曲线分析。在溶解曲线分析过程中，随着温度从低于产物溶解点缓慢升到高于产物溶解点，实时仪器连续监测每个样品的荧光值。基于产物长度和G/C含量的不同，扩增产物会在不同的温度点解链。随着产物的解链，可以看到荧光值的降低并被仪器所测量。对溶解曲线进行微分可以计算出溶解峰。