Quickchange-一步搞定基因定点突变引物设计！
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为了研究某一基因的功能，我们通常不仅需要研究其野生型基因的功能，也需要进一步去挖掘它发挥作用时是哪一个结构域，甚至是哪一个氨基酸发挥了作用，而这里面就涉及到了如何设计定点突变引物的问题。
今天为大家介绍一个在线网址—quickchange primer design，可以非常方便快捷为我们设计出合适的引物。
网站链接：https://www.agilent.com/store/primerDesignProgram.jsp
该网站可以设计单点和多点突变引物以及删除或者插入一段 DNA 序列（插入时只能插入小的 DNA 片段）。我们今天着重讲解如何利用该网站设计引物，并利用该引物构建出我们想要的突变体。
如果我们实验室又穷，又不想买突变试剂盒怎么办？我们可以不用管第 2 步，默认其设置，不用试剂盒也可以构建出我们想要的突变体。
第 3 个选项输入我们的 DNA 序列，既可以通过 Browse 选项上传已经下载好的序列，也可以直接粘贴文本格式或 FASTA 格式的 DNA 序列。第 4 步将 DNA 序列转换成蛋白序列（Upload Translated）。下面我们以人的 TP53 基因为例进行演示：
首先我们从 NCBI 上下载 TP53 基因序列，将其粘贴到相应选项框内，并转换为氨基酸序列，如下图：
同时我们也会看到多出来的选项 5，如果我们要进行点突变，则需要勾选 5 后面的灰色圆圈
在下面这个框选中我们要突变的目的氨基酸，如红色圆圈标出所示：
同时在下面选框勾选出我们想要突变成的氨基酸，这个就表示我们将 N29 突变为 I（N29I），S33 突变为 K (S33K)，L35 突变为 E (L35E)，E55 突变为 C (E55C)
该网站可以同时设计针对 7 个氨基酸的突变引物, 接下来点击 Primer Design 即可得到引物序列：
同时也能看到对应引物的长度及其相应的 Tm 值：
也能看到引物与模板相互匹配的序列：
接下来我们再讲如何删掉一段 DNA 序列，同样我们选择 or 下面的小圆框，选中两个氨基酸，即可设计出删掉这两个氨基酸之间片段的引物（注意：这两个氨基酸不会被删除）。
比如我们想删掉第 29 个氨基酸和第 51 个氨基酸之间的片段，我们可选中 29N 和 51E 即可，如下图
依旧点击 Primer Design 即可设计出引物，且能看到引物与模板之间的配对情况。
1. 如下是我的 PCR 反应体系：
Nuclease-free water：up to 50 μL
2. 然后就按照你所买的 DNA 高保真酶（PCR Enzyme）的说明书设置 PCR 反应条件，我一般设置 30 个循环。
3. PCR 反应结束后，直接加入 Dpn I 限制性内切酶（待突变的质粒在细菌中会被甲基化修饰，因此，用 Dpn I 可以消化掉相应的模板质粒，而使突变质粒保留下来）及相应的 buffer，37℃ 酶切反应 1 h 左右 (也可相应的缩短或延长酶切反应时间)。
4. 直接用 DNA 回收试剂盒进行胶回收，根据浓度，取 100ng 进行转化，涂平板。
5. 第二天即可挑取单菌落送测序。
6. 随后将测序正确的样品提质粒，即可进行后续相关实验。
注：个人经验，一般单点突变成功率较高，可达 100%。在进行多点突变时可将多对引物放在一个 PCR 反应体系中进行，但相应的效率也会降低。笔者做过同时突变两个点和四个点，将突变引物全部加到一个体系中，阳性率在 25%～60% 之间不等。
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