快速定量检测动物源性食品中 β-受体激动剂残留
β-受体激动剂是一类苯乙醇胺类化合物，在动物体内能减缓或减少脂肪沉积，增加肌肉蛋白沉淀，提高动物胴体瘦肉率、增重和提高饲料转化率，当用于牛、羊、禽、猪等畜禽的促生长剂、饲料添加剂时，会提高其瘦肉率，但同时，β-受体激动剂类药物也可引起心室早搏，四肢、脸、颈部骨骼肌震颤，还引发代谢紊乱，对糖尿病人可发生酸中毒或酮中毒。由于其严重的危害性，在许多国家包括欧盟和中国已禁止在饲料中添加这些化合物，相关标准规定需对动物源性食品、饲料、饮用水中该类化合物的残留量进行检测。
β-受体激动剂类药物进入人或动物体内后，通过糖苷键结合参与代谢，转换为葡萄糖醛酸轭合物或硫酸轭合物。所以β-受体激动剂的检测通常需要酶解步骤，β-葡萄糖醛酸酶是一种可以使葡萄糖醛酸苷键加水分解的酶，它可以把葡萄糖醛酸轭合物或硫酸轭合物的糖苷键切断，释放出游离态。
目前，β-受体激动剂类药物残留的检测方法包括高效液相色谱法（HPLC）、气相色谱-质谱法（GC-MS）、液相色谱-质谱/质谱法（LC-MS/MS）、毛细管电泳电气化学检测法。
下面介绍使用新型重组酶 IMCSzyme® β-葡萄糖醛酸酶与 MicroSep® DPX 枪头式分散固相微萃取柱对动物源性食品中 β-受体激动剂残留量进行 LC-MS/MS 法检测的样品前处理流程：
一、酶解：
(1) 精确称取（0.2±0.002）g 搅碎的试样于 2 mL 离心管中；
(2) 加入 200 µL IMCSzyme® 快速水解缓冲液（Rapid Hydrolysis Buffer），充分混匀；
(3) 加入 5 µL IMCSzyme® β-葡萄糖醛酸酶，轻度涡旋混匀；
(4) 37 ℃ 水解 2 小时。
二、样品提取：
(1) 在酶解后的待测样品中加入内标工作液，均质 30 s；
(2) 加入 1000 µL 乙腈，涡旋振荡 1 分钟 ；
(3) 在转速 14000 r/min 离心 20 min；
(4) 分离上清液至新的离心管中， 60 ℃ 氮气吹干；
(5) 将吹干的残渣用 750 µL 水溶解，作为待净化液。
三、净化：
（1）上枪头
A. 用手动移液液或移液工作站连接 MicroSep® DPX 枪头式分散固相微萃取柱；（以下描述以手动移液枪 + 1 mL MicroSep® DPX tips 为例；如使用移液工作站，则可将下列操作由程序设定完成）
如「 500 µL 甲醇吸打一次」的意思是：
A. 将 1 mL 移液枪刻度调至 1 mL，连接 1 mL MicroSep® DPX tips；
B. 将移液器控制按钮按至 1 档，将枪头插入至液面下（要保证容器内的液体体积是所需吸打的液体体积），缓慢释放按钮吸入液体，注意不要完全释放按钮）；
C. 待 500 µL 甲醇吸取完成，将移液枪提离容器，继续缓慢释放按钮，可以看到有气体持续进入枪头中，形成湍流，待按钮完全释放后，停留 30s ～ 1 min；
D. 将吸入的甲醇慢慢打出至原容器中，完成一次吸打。
（2）平衡
A. 用 500 µL 甲醇吸打 2 次；
B. 用 500 µL 水吸打 2 次。
（3）样品结合
A. 样品溶液 750uL 吸打 4 次。
（4）洗涤
A. 用 750 µL 水吸打 2 次；
B. 用 750 µL 2% 甲酸/水溶液吸打 2 次；
C. 用 750 µL 甲醇吸打 2 次。
（5）洗脱
A. 新鲜配制 750 µL 5% 氨水甲醇溶液吸打 3～ 5 次。
（6）氮吹回溶
A. 洗脱液在 60 ℃ 下氮气吹干；
B. 残余物用 0.1% 甲酸-甲醇水溶液（甲醇：水 = 5：95）100～200 µL 溶解；
涡旋混匀，过滤后，供高效液相色谱-串联质谱仪（LC-MS/MS）测定。
四、检测方法
(1) 色谱条件
色谱仪：Acquity 超高效液相色谱仪（美国 Waters 公司）
色谱柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18（50 mm × 2.1 mm, 1.7 µm）
流动相：A 为 0.1 %（V/V）甲酸水溶液，B 为 0.1 %（V/V）甲酸乙腈溶液
柱温：35 ℃
流速：0.2 mL/min
进样量：5 µL
流动相梯度条件：见表 1
表 1 流动相梯度条件条件
时间 (min） | 流速（mL/min) | A/% | B/% |
0 | 0.2 | 96 | 4 |
3 | 0.2 | 92 | 8 |
7 | 0.2 | 60 | 40 |
7.5 | 0.2 | 5 | 95 |
8.5 | 0.2 | 5 | 95 |
9.6 | 0.2 | 96 | 4 |
（2）质谱条件
质谱仪：XEVO TQ-S 串联质谱仪（美国 Waters 公司）
离子源：电喷雾离子源（ESI），正离子模式
采集方式：多反应监测（MRM）
毛细管电压：3 kV
干燥气流速：650 L/h
去溶剂温度：350 ℃
其他质谱参数：见表 2
表 2 β-受体激动剂的质谱参数
化合物 | 母离子 (m/z) | 子离子 (m/z) | 碰撞能量（eV） | 锥孔电压（V） |
特布他林 Terbutaline | 226.1 | 152.0 * | 15 | 30 |
107 | 30 | |||
西玛特罗 Cimaterol | 220.1 | 160.1 * | 15 | 30 |
116 | 25 | |||
沙丁胺醇 Salbutamol | 240.1 | 148.0 * | 20 | 25 |
166 | 12 | |||
莱克多巴胺 Ractopamine | 302.1 | 164.0 * | 15 | 25 |
107 | 30 | |||
克伦特罗 Clenbuterol | 277 | 202.9 * | 15 | 25 |
168 | 28 | |||
溴布特罗 Brombuterol | 367.1 | 292.8 * | 18 | 30 |
213.9 | 30 | |||
溴代克伦特罗 Bromchlorbuterol | 321 | 247.0 * | 16 | 25 |
168 | 27 | |||
马布特罗 Mabuterol | 311.1 | 237.0 * | 25 | 30 |
217 | 15 | |||
班布特罗 Bambuterol | 368.31 | 72.1 * | 30 | 22 |
294.3 | 20 | |||
克伦特罗-D9 Clenbuterol-D9 | 286.1 | 204 | 16 | 30 |
特布他林-D9 Terbutaline-D9 | 235.3 | 153 | 15 | 30 |
五、待检测样品较多时，有没有更好的解决方案？
MicroSep® DPX Tips 可适配 Hamilton，Integra 等自动移液系统，轻松实现高通量样品制备。（大部分型号的 LC 都有 96 孔板的适配器，可以在 96 孔板中完成样品制备并直接上样 LC，但 GC 一般没有 96 孔板的适配器，所以如果在 96 孔板中完成样品制备后，需有合适方法将样品转移至 GC 的进样瓶中。
推荐方案一：Integra Assist/Assist Plus + 1250 μL MicroSep® DPX Tips
Integra Assist 可一次处理 1～12 个样品（Assist Plus 可适配可调间距移液枪），界面简单，可通过简单的操作将所需净化处理过程存储为程序方便重复使用。
优点：价格便宜，操作简便，方便样品转移（无论是 LC 还是 GC 都很方便使用）
缺点：处理样品相对较少；板位较少，可能需要人工加各步所需缓冲液
推荐方案二：Integra Viaflo 96 + 1250 μL MicroSep® DPX Tips
Integra Viaflo 96 微孔板移液器，是一款经济实用型的电动移液系统，主要使用 96 孔板，界面简单，可通过简单的编程将所需净化处理过程存储为程序方便重复使用。
优点：价格适中，操作简便，32 个以下样品可实现全自动处理（视具体实验过程）
缺点：较多样品时，需手动换板；如后端是 GC，则需要 VOYAGER II 辅助完成样品转移。
推荐方案三：Hamilton Microlab® 液体处理工作站 + 1 mL MicroSep® DPX Tips
Microlab® STAR 系列工作站是以液体处理为核心的生物医药实验室自动化操作平台的巅峰之作，拥有多项世界领先水平的专利技术，也是用户定制型自动化实验操作平台，可进行自动的加样、试剂分配、超微量移液，以及与液体处理相关的振荡、孵育等操作。如果整合第三方设备，可将整个实验流程实现全自动化。
Microlab® NIMBUS 是紧凑而灵活的小型自动化移液系统，它基于 Hamilton 优良的工作站传统，适用于小通量的应用。NIMBUS 高效率的台面设置提高了最快的速度、最高的吸头定位精度以及移液准确性。
优点：功能强大，高通量、实验流程全自动，结合 MicroSep® DPX Tips 可完美解决食品安全、司法鉴定、药物代谢、医药研发等检测、分析、科研领域的各种样品制备、提纯问题。
缺点：程序编制较复杂
