WB操作规程

一、设备和试剂

1．设备

① 电泳电源
Mini-PROTEAN 3 Elecreophoresis Cell,Mini Teans-Blot Module,and PowerPac Basic Power Supply (BIO-RAD,Catalog#165-3323)

② 电泳仪及附件
Mini-PROTEAN 3 Elecreophoresis Cell (BIO-RAD,Catalog#165-3301)

③ 电转仪及附件
Mini Teans-Blot Elecreophoresis Transfer Cell (BIO-RAD,Catalog#170- 3930)

④ NC膜
PIERCE，Catalog#88018

⑤ 滤纸
Whatman,3MM CHR

2.试剂

① 凝胶试剂
试剂名称 厂家及规格
30%丙烯酰胺溶液 上海生工
Tris-Base SIGMA
10%SDS SIGMA
10%过硫酸铵 上海生工
TEMED 上海生工

② 常用溶液及缓冲液
A．5%积层胶所用溶液
B．分离胶溶液
C．电泳缓冲液，1L
3g Tris-Base、14.4g 甘氨酸、1g SDS，加蒸馏水至IL，pH应该在8.3左右。也可以制成10×的储存液，在室温下长期保存
D．电泳转移缓冲液,1L
3g Tris-Base、14.4g 甘氨酸、甲醇200ml, 加蒸馏水至1L, 也可以制成10×的储存液，在湿温下长期保存
E．5×样品缓冲液,10ml
0.6ml 1mol/L的Tris-HCl（Ph6.8）、5ml 50%的甘油、2ml 10%的SDS、0.5ml 2-巯基乙醇、1ml 1%溴酚蓝，0.9ml的蒸馏水，可在4℃保存数周，或在-20℃保存数月。

③ 二抗稀释液
AP-Anti mouse IgG(Whole molecule),SIGMA,CAT#A-3562;
AP-Anti mouse IgGAM,ZYMED,CAT#62-6422
一般采取1:3000-1:5000的稀释度，用1%BSA-PBS（含0.05%TWEEN20）稀释

④ 显色底物缓冲液
A.HRP标记二抗底物缓冲液
DAB KIT（KPL LOT NO YM107 CAT：54-10-00）, Tris Buffer 3滴，DAB Substrate 3滴,Peroxide solution 2滴于5ml蒸馏水中，避光，混匀
B.AKP标记二抗底物缓冲液
AKP缓冲液：
0.1mol/L Tris-HCL（PH9.5）, 0.1mol/L NaCL, 5mmol/L MgCL2
BCIP溶液/NBT溶液：
50mg/ml BCIP溶于100%二甲基甲酰胺
50mg/ml BCIP溶于70%二甲基甲酰胺

⑤ 其他试剂
A． 考马斯亮蓝染液，1L
考马斯亮蓝R-250 1.0g、甲醇 450ml、冰醋酸 100ml
B． 考马斯亮蓝脱色液
甲醇 100ml、冰醋酸 100ml、蒸馏水800ml

二、方法
1．Bio-Rad微型凝胶电泳模具的安装
带上手套将凝胶电泳系统的前后玻璃板，梳子用去污剂洗涤，最后再用去离子水冲洗干净，除去黏附在玻璃板上凝固的胶和其他污垢。晾干玻璃板或用电吹风吹干。将玻璃板的橡胶垫条用吸水纸吸干，然后按Bio-Rad Mini-Protean电泳系统的使用说明书安装好玻璃板，固定于制胶板上。

2．SDS-PAGE凝胶的配制

① 根据实验检测抗原的分子量大小选择合适的电泳分离胶浓度。确定分离胶所需凝胶溶液体积（这些数据一般由厂家提供，例如Bio-Rad Mini-Protean 3 Elecreophoresis Cel 83mm×75mm×0.75mm,两块胶需8ml）
按下表给出数据在一小烧杯中按所需丙烯酰胺浓度配置一定体积的分离胶溶液。依次混合各成分。

10ml分离胶各成分所需体积（ml）
浓度
溶液成分 8% 12% 15%
水 4.6 3.3 2.3
30%丙烯酰胺 2.7 4.0 5.0
1.5mol/L Tris(pH8.8) 2.5 2.5 2.5
10%SDS 0.1 0.1 0.1
10%过硫酸铵 0.1 0.1 0.1
TEMED 0.006 0.004 0.004
一旦加入TEMED，马上开始聚合，故应立即快速旋动混合物并进入下步操作。

② 迅速在两玻璃板的间隙中灌注丙烯酰胺溶液，不能有气泡，留出灌注积层胶所需空间（梳子的齿长再加1cm）。然后小心的在分离胶溶液上覆盖一层1-5mm的水层，这使凝胶表面变的平整。

③ 等待30-60min，使凝胶聚合。当凝胶聚合后，在分离胶和水层之间会出现一个清晰的界面，可以微微倾斜模具，检测凝胶是否聚合。用去离子水洗涤凝胶顶部数次以除去未聚合的凝胶，尽可能排去凝胶上的液体，再用滤纸吸净残留液体，注意不要接触胶面。

④ 按下法制备积层胶：按下表给出数据在一个干净的试管或小烧杯中制备一定体积浓度为5%的丙烯酰胺溶液，依次混合各成分。（两块5%积层胶Bio-Rad Mini-Protean 83mm×75mm×0.75mm, 两块胶需3ml）

不同体积积层胶各成分所需体积（ml）
体积
溶液成分 2 3 5
水 1.4 2.1 3.4
30%丙烯酰胺 0.33 0.5 0.83
1mol/L Tris(pH6.8) 0.25 0.38 0.63
10%SDS 0.02 0.01 0.05
10%过硫酸铵 0.02 0.03 0.05
TEMED 0.002 0.003 0.005
一旦加入TEMED，马上开始聚合，故应立即快速旋动混合物并进入下一步操作。

⑤ 在已聚合的分离胶上直接灌注积层液。立即在积层胶溶液中插入干净的实验预设计的梳子，小心避免混入气泡，将凝胶垂直放置于室温下。

⑥ 积层胶聚合完全后（30min）,小心移出梳子，使用洗瓶立即用去离子水洗涤加样槽以除去未聚合的丙烯酰胺。把凝胶固定于电泳装置上，上下槽各加入Tris甘氨酸电泳缓冲液。

3．SDS-PAGE电泳

① 将抗原（细胞裂解液、重组蛋白）样品置于凝胶加样缓冲液中，在100℃加热三分钟以使蛋白质变性。

② 设计加样顺序，作好实验记录，按预定顺序加样。一般每个电泳道加样最大体积为25µl,每个电泳道上样的最低蛋白质量（每一条蛋白质条带）：0.1µg（考马斯亮蓝染色）-2ng（银染色）,最高蛋白质量（蛋白质混合物）：20-40µg。

③ 把电泳装置与电源连接好，将电压调至200V，电流应流向阳极，待溴酚蓝迁移到分离胶底部0.5cm处，关闭电源。

④ 从电泳装置上卸下凝胶玻璃板，用去离子水冲洗干净。准备进行免疫印操作。

4．免疫印迹操作-转膜

① 将凝胶玻璃板置于盛有电泳转移缓冲液的容器中，浸泡15-20min.

② 带上手套，裁剪好滤纸（Whatman,3MM CHR）和NC膜，滤纸和膜大小为83mm×75mm，尽量避免污染滤纸和膜，将裁减好的滤纸和膜浸泡与电泳转移缓冲液中，驱除留于膜上的气泡。

③ 打开转移盒并放置浅盘中，用转移缓冲液将海绵垫完全浸透后将其放在转移盒壁上，海绵上再放置一张浸湿的Whatman,3MM滤纸。

④ 小心将凝胶放置于滤纸上，避免气泡（用转移缓冲液润湿并戴手套以转移缓冲液润湿胶面，小心将NC膜放在胶面上，从凝胶的一边开始轻轻放下可避免气泡，注意一定要戴手套或镊子接触膜）。

⑤用去离子水清洗缓冲液槽，在缓冲液槽中放入搅拌子，将另一块海绵用转移缓冲液浸透后放在凝胶-膜“三明治”上，关上转移盒并插入转移槽。

⑥将冰盒装入缓冲液槽，注满4℃预冷的转移缓冲液。

⑦将整个装置放在磁力搅拌器上并开始搅拌，连接好转移电极恒压100V转移90min，若转移过夜则恒压30V。

⑧电转完毕后，将NC膜置于5%的脱脂奶粉（PBS配制）中封闭，37℃2小时或4℃过夜。

5．免疫检测

一抗与靶蛋白的结合

① 封闭的膜用PBST漂洗2-3次。

② 将加样槽洗涤干净，用蒸馏水润洗，晾干，将膜用一次性手套覆盖好，按标记和实验设计切下膜条（一般为3 mm宽左右）按顺序置于加样槽中，作好实验记录，加入相应的一抗约1ml，注意保证膜的所有部分同溶液接触。

③ 室温下于摇床孵育2h或4℃过夜。

④ 弃去一抗，膜条仍置于加样槽，每个槽加2-3 mlPBST，上摇床洗涤洗涤5-10min ，换液，反复4次。

酶标记二抗与一抗的结合

① 根据实验需要和设计选择合适的酶标二抗和稀释浓度（用含0.5%脱脂奶粉的PBS稀释），每个加样槽中加入二抗1ml左右室温下于摇床孵育1h或4℃过夜，注意保证膜的所有部分同溶液接触。

②弃去二抗，膜条仍置于加样槽，每个槽加2-3 mlPBST，上摇床洗涤洗涤5-10min ，换液，反复4次。

显色反应（注：二抗一般有两种常用标记酶，HRP和AP，其相对应的显色底物试剂盒为DAB和BCIP/NBT）

① HRP标记二抗显色

用DAB KIT（KPL LOT NO YM107 CAT：54-10-00）显色，按顺序依次加Tris Buffer 3滴，DAB Substrate 3滴,Peroxide solution 2滴于5ml蒸馏水中，避光，混匀，将膜加入显色液中避光显色15 min左右终止反应，记录实验结果，将NC膜晾干扫描保存

② AKP标记二抗显色

用AKP缓冲液洗膜5min，弃去AP缓冲液，加入显色液（66µlNBT溶液同10mlAKP缓冲液充分混合均匀后加入33µl BCIP溶液1h内使用），室温下显色（37℃可加速反应），显色反应通常在30min内可完成。用20mM EDTA/TBS洗膜终止反应,记录实验结果，将NC膜晾干扫描保存。反应溶液可预先配置，可在4℃储存一年以上。

三、说明

1． WB对照系统

阳性对照：最好有标准品，或阳性血清、阳性上清。
阴性对照：测血时用相应小鼠未免疫血清，测培养上清，用无克隆培养上清。
空白对照：不加一抗，用1%BSA代替。
无关对照（替代对照）：用无关项目一抗，或无关项目的抗体。

2.切割膜时，大小一般为3-5mm,一抗的体积为每条膜保证1ml。

3.KSHV、MCMV、HCMV项目测血时，血清稀释度为1:500-1:1000。

4. KSHV、MCMV、HCMV项目WB鉴定时，一抗如为IgG型,二抗采用AP-Anti mouse IgG(Whole molecule),SIGMA,CAT#A-3562; 一抗如为IgM型，二抗采用AP-Anti mouse IgGAM,ZYMED,CAT#62-6422。

5.多肽项目WB鉴定，二抗全部采用AP-Anti mouse IgG(Whole molecule),SIGMA,CAT#A-3562