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Real-time qPCR手册---手把手教你从菜鸟到高手

由于Real-time qPCR的众多优点，现在已经是生命科学领域的一项常规技术。越来越多的研究文章中涉及RT-PCR的实验，也基本上被real-time qPCR所代替。由于real-time aPCR 输出的数据不同于常规的PCR 电泳检测，很多没有做过real-time qPCR的研究者常常感到高深莫测，不知从何入手；甚至一些做过次实验的研究者也会对数据处理分析感到迷惑，不知所措。

本文就从real-time qPCR的发展史说起，包括real-time qPCR的原理，实验设计，实际操作，数据分析，常见问题解答五个方面，手把手教你从各个方面了解real-time qPCR，彻底的从菜鸟到高手！

一、Real-time qPCR发展史

Real-time qPCR就是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct 值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依据。由于常规的PCR的缺点，real-time qPCR由于其操作简便，灵敏度高，重复性好等优点发展非常迅速。现在已经涉及到生命科学研究的各个领域，比如基因的差异表达分析，SNP检测，等位基因的检测，药物开发，临床诊断，转基因研究等。

在Real-time qPCR技术的发展过程中，定量PCR仪的发展起了至关重要的作用。1995年，美国PE公司（已经并入Invitrogen公司）成功研制了Taqman技术，1996年推出了首台荧光定量PCR检测系统，通过检测每个循环的荧光强度，通过Ct值进行数据分析。从而荧光定量PCR获得广泛应用。现在的定量PCR仪有ABI7000、7300、7500，7700、7900HT、StepOnePlusTM、StepOneTM、PRISM@StepOneTM系列；BIO-RAD的CFX96、iCycler iQ5@、MyiQ@、MJ Research Chromo4TM Opticon 系列；Stratagene MxTM系列；Roche LightCycler@系列；Eppendorf Masercycler@；Corbett Rotor-GeneTM；Cepheid SmartCycler@和BIOER的LineGene系列。

随国内生命科学的快速发展，科研水平不断提高，发高水平文章已不再是新鲜事。与其同时，国内公司经过长期不懈的努力，也有自主研发的real-time PCR仪器生产比如西安天隆科技公司的TL系列仪器。

二、Real-time qPCR概述

1. Real-time qPCR原理

实时PCR就是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测。一般来讲，定量PCR仪包括：实时荧光定量PCR仪主要由样品载台、基因扩增热循环组件、微量荧光检测光学系统、微电路控制系统、计算机及应用软件组成。其中基因扩增热循环组件工作原理与传统基因扩增仪大致相同，不同厂家不同型号的产品分别采用空气加热、压缩机制冷、半导体加热制冷等工作方式。独特是这个微量荧光检测系统。有由荧光激发光学部件、微量荧光检测部件、光路、控制系统组成。

常用的荧光激发方式有两种：卤钨灯和LED；荧光检测元件常用两种方式：光电倍增管和冷光CCD摄像机，光单色元件有滤光片和光栅。在实时PCR扩增过程中，荧光信号被收集，转化为成为扩增和熔解曲线。具体数据就是基线，荧光阈值和Ct值。

2. Real-time qPCR的数学原理

首先来看一个real-time qPCR中的重要参数Ct值（Ct value），阈值（threshold），和基线（baseline）。一般来讲，第3-15个循环的荧光值就是基线，是由于测量的偶然误差引起的。阈值一般是基线的标准偏差的10倍。在实际操作中也可以手动调节，位于指数期就可以。Ct值就是荧光值达到阈值时候的PCR循环次数。所以是一个没有单位的参数。

那么为什么说Ct值跟初始模板的量成反比呢？我们来看PCR的扩增方程：

从线性方程上看，斜率（slope）为-1/lg(1+E)，所以E=10-1/slope-1。如果从标准曲线上得到斜率（-3.3），就可以算出扩增效率（0.99）。一般来讲PCR扩增效率在90%-110%都是可以用于数据分析的。效率低于100%，是由于PCR反应中存在抑制因素；而高于100%可能一些污染、非特异性扩增或者是引物二聚体造成。

3. Real-time qPCR的种类

根据real-time qPCR的化学发光原理可以分为2大类：一类为探针类，包括TaqMan@探针和分子信标，利用与靶序列特异杂交的探针来指示扩增产物的增加；一类为非探针类，其中包括如SYBR@Green I或者特殊设计的引物(如LUX@Primers) 通过荧光染料来指示产物的增加。

3.1 Taqman@探针法

Taqman@探针是最早用于定量的方法。就在PCR扩增时加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸：5’端标记一个报告荧光基团，3’端标记一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，也就是FRET反应；PCR扩增时，Taq酶的5'-3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。而新型TaqMan-MGB探针使该技术既可进行基因定量分析，又可分析基因突变（SNP），有望成为基因诊断和个体化用药分析的首选技术平台。

3.2 分子信标法

分子信标：一种在靶DNA不存在时形成茎环结构的双标记寡核苷酸探针。在此发夹结构中，位于分子一端的荧光基团与分子另一端的淬灭基团紧紧靠近。分子信标的茎环结构中，环一般为15-30个核苷酸长，并与目标序列互补；茎一般5-7个核苷酸长，并相互配对形成茎的结构。荧光基团连接在茎臂的一端，而淬灭剂则连接于另一端。分子信标必须非常仔细的设计，以致于在复性温度下，模板不存在时形成茎环结构，模板存在时则与模板配对。与模板配对后，分子信标的构象改变使得荧光基团与淬灭剂分开。当荧光基团被激发时，它发出自身波长的光子。

3.3 SYBR@Green 法

SYBR@Green I是一种结合于小沟中的双链DNA结合染料，与双链DNA结合后，其荧光大大增强。这一性质使其用于扩增产物的检测非常理想。SYBR@Green I 的最大吸收波长约为497nm，发射波长最大约为520nm。在PCR反应体系中，加入过量SYBR@Green 荧光染料，SYBR@Green 荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR@Green 染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。

3.4 LUX@Primers法

LUX@ (light upon extention) 引物是利用荧光标记的引物实现定量的一项新技术。目标特异的引物对中的一个引物3’端用荧光报告基团标记。在没有单链模板的情况下，该引物自身配对，形成发夹结构，使荧光淬灭。在有目标片断的时候，引物与模板配对，发夹结构打开，产生特异的荧光信号。

4. Real-time qPCR和常规PCR的区别


实时检测（在对数扩增时期）而不是终点检测


敏感性高


需要样品少


特异性高


精确定量

三、Real-time qPCR实验设计

实验设计其实比实验本身更重要！好的实验设计可以事半功倍，节省时间！尤其做生物实验，一定要查询尽可能完全的相关资料，整理好思路，设计好实验路线。当然实验过程中出现各种各样的变化，但有足够多的背景知识，就可以分析原因，才有可能创新。对于一个real-time qPCR而言，首先就是实验材料的处理和准备；然后引物设计，这步至关重要，好的引物是实验本身成功的50%；进行实验和数据分析（这一部分单独说明）。

1. 实验材料的处理和准备

以最基本的基因表达差异分析为例。实验材料分为对照组（CON）和处理组（TRT）。组内要有生物重复，可以数据分析此处理是否有统计意义。在材料收集过程中，尽量避免RNA的降解（尤其对于绝对定量的样品）。

一般传统的收集材料的方法是样品采集立刻液氮速冻，然后迅速转移到超低温冰箱保存，但这种方法携带不方便，由于对于异地取材。现在新技术的发展，也有一些非液氮类的样品储存液 ，比如百泰克的RNAfixer 。

2. 引物设计

一般real-time PCR引物的设计遵循下面一些原则：


扩增产物长度在80-150bp。


引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。


产物不能形成二级结构。


产物长度一般在15-30碱基之间。


G+C含量在40%-60%之间。


碱基要随机分布。


引物自身不能有连续4个碱基的互补。


引物之间不能有连续4个碱基的互补。


引物5’端可以修饰。


引物3’端不可修饰。


引物3’端要避开密码子的第3位。

Taqman@探针的设计稍有不同，一般有公司设计合成。遵循下面以下原则：


尽量靠在上游引物；


长度30-45bp，Tm比引物高至少5℃；


5’端不要是G，G会有淬灭作用，影响定量

四、Real-time qPCR操作过程

1. RNA提取和反转录

在抽提RNA过程中任一环节的不正确操作都可能导致RNA酶的污染。由于RNA酶的活性很难完全抑制，预防其污染是十分必要的。在实际的操作中应遵循下面一些原则：

1. 全程佩戴一次性手套。皮肤经常带有细菌和霉菌，可能污染RNA的抽提并成为RNA酶的来源。培养良好的微生物实验操作习惯预防微生物污染。

2. 使用灭菌的，一次性的塑料器皿和自动吸管抽提RNA，避免使用公共仪器所导致的RNA酶交叉污染。例如，使用RNA探针的实验室可能用RNA酶A或T1来降低滤纸上的背景，因而某些非一次性的物品（如自动吸管）可能富含RNA酶。

3. 在提取裂解液中，RNA是隔离在RNA酶污染之外的。而对样品的后续操作会要求用无RNA酶的非一次性的玻璃器皿或塑料器皿。玻璃器皿可以在150°C的烘箱中烘烤4小时。塑料器皿可以在0.5M NaOH中浸泡10分钟，用水彻底漂洗干净后高压灭菌备用。

当然，这些也不是绝对的要求。如果是操作熟练。完全可以用初次开封的离心管和枪头，新过滤的超纯水，进行RNA的提取。

2.Mix配制

一般来讲，进行real-time qPCR MasterMix都是2×的浓缩液，只需要加入模板和引物就可以。由于real-time qPCR灵敏度高，所以每个样品至少要做3个平行孔，以防在后面的数据分析中，由于Ct相差较多或者SD太大，无法进行统计分析。通常来讲，反应体系的引物终浓度为100-400mM；模板如果是总RNA一般是10ng-500，如果cDNA，通常情况下是1ul或者1ul的10倍稀释液，要根据目的基因的表达丰度进行调整。当然这些都是经验值，在操作过程中，还需要根据所用MasterMix，模板和引物的不同进行优化，达到一个最佳反应体系。在反应体系配置过程中，有下面几点需要注意：

1. MasterMix不要反复冻融，如果经常使用，最好溶解后放在4度。

2. 更多的配制Mix进行，减少加样误差。最好能在冰上操作。

3. 每管或每孔都要换新枪头！不要连续用同一个枪头加样！

4. 所有成分加完后，离心去除气泡。

5. 每个样品至少3个平行孔。

参比或者校正染料（reference dye，passive dye）常用的是ROXTM（现在已经是ABI的注册商标了！）或者其他染料，只要不影响检测PCR产物的荧光值就可以。参比染料的作用是标准化荧光定量反应中的非PCR震荡，校正加样误差或者是孔与孔之间的误差，提供一个稳定的基线。现在很多公司已经把ROXTM配制在MasterMix或者Premixture里。如果反应曲线良好或已经优化好反应体系，也可以不加ROXTM染料校正。

通常来讲，real-time qPCR的反应程序不需要像常规的PCR那样，要变性、退火、延伸3步。由于其产物长度在80-150bp 之间，所以只需要变性和退火就可以了。SYBR@Green等染料法，最好在PCR扩增程序结束后，加一个溶解程序，来形成溶解曲线，判断PCR产物的特异性扩增。而溶解程序，仪器都有默认设置，或稍有不同，但都是一个在产物进行溶解时候，进行荧光信号的收集。

3. 仪器设置

所有仪器的操作都基本一致。设置的时候包括反应板设置（plate setup）和程序设置（program setup）。我们以 ABI StepOne为例，详细看一下反应设置：

A. 首先是实验目的选择：定量还是其他。我们命名为“BioTeke”，进行“定量”实验。

B. 实验方法的选择：我们选用的比较Ct的SYBR Green方法， Fast程序，以cDNA为模板进行。

C. 目的基因的设置：有几个目的基因和目的基因的名称。

D. 样品的设置：包括哪个是实验组，哪个是对照组。以及负对照的设置和生物重复的设置。

E. 对照组和内参基因的设置：这个是为后面的定量做准备

F. 反应程序的设置：PCR反应程序的设置要根据不同公司的MasterMix。比如BioTeke的95℃ 2分钟就可以激活DNA聚合酶（ABI的需要10 分钟）。循环反应是95℃15秒，60℃15秒的40个循环。溶解曲线程序采用仪器默认设置就可以。或者是仪器说明书上建议的程序。

G. 反应体系的设置：

A-G这五个步骤简单设置好，可以保存，修改反应程序或者立刻进行反应。

需要注意一点ABI仪器需要加ROX参比染料，默认的是ROX。有些公司是把ROX或者其他染料配制在MasteMix里面；也有的是单独分开。要根据不同公司的MasterMix进行这一个步骤的选择。BioTeke的MasterMix里没有参比染料，所以选择“none”。

设置好之后，就可以把配置好的PCR管放进仪器，点击RUN！

五、Real-time qPCR数据分析

1. Real-time qPCR常见参数


基线（baseline）

通常是3-15个循环的荧光信号

同一次反应中针对不同的基因需单独设置基线


阈值（threshold）

自动设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍

手动设置：置于指数扩增期，刚好可以清楚地看到荧光信号明显增强。

同一次反应中针对不同的基因可单独设置阈值，但对于同一个基因扩增一定要用同一个阈值。


Ct值:与起始浓度的对数成线性关系。

分析定量时候一般取Ct:15-35。太大或者太小都会导致定量的不准确。


Rn（Normalized reporter）是荧光报告基团的荧光发射强度与参比染料的荧光发射强度的比值。

△Rn：△Rn是Rn扣除基线后得到的标准化结果（△Rn=Rn-基线）。

2.影响Ct值的关键因素


模板浓度

模板浓度是决定Ct的最主要因素。控制在一个合适范围内，使Ct在15-35之间。


反应液成分的影响

任何分子的荧光发射都受环境因素影响----比如溶液的pH值和盐浓度。


PCR反应的效率

PCR反应的效率也会影响Ct值。在PCR扩增效率低的条件下进行连续梯度稀释扩增，与PCR扩增效率高的条件下相比，可能会所产生斜率不同的标准曲线。PCR效率取决于实验、反应混合液性能和样品质量。一般说来，反应效率在90-110%之间都是可以接受的。

3. 如何评估实时定量PCR反应的效果


PCR扩增效率：

为了正确地评估PCR扩增效率，至少需要做3次平行重复，至少做5个数量级倍数(5logs)连续梯度稀释模板浓度。


R2值：

另一个评估PCR效率的关键参数是相关系数R2，它是说明两个数值之间相关程度的统计学术语。如果R2等于1，那么你可以用Y值（Ct）来准确预测X值（量）。如果R2等于0，你就不能通过Y值来预测X值。R2值大于0.99 时，两个数值之间相关的可信度很好。


精确度:

标准偏差（standard deviation，偏差的平方根）是最常用的精确度计量方法。如果许多数据点都靠近平均值，那么标准偏差就小；如果许多数据点都远离平均值，则标准偏差就大。实际上，足够多重复次数产生的数据组会形成大致的正态分布。这经常可通过经典的中心极限理论来证明，独立同分布随机变量在无限多时趋向于正态分布。如果PCR反应效率是 100%，那么2倍稀释点之间的平均Ct间隔应该恰为1个Ct值。要以99.7%的几率分辨2倍稀释浓度，标准偏差就必须小于等于0.167。标准偏差越大，分辨2倍稀释的能力就越低。为了能够在95%以上的情况下分辨出2倍稀释，标准偏差必须小于等于 0.250。


灵敏度：

无论CT绝对值是多少，任何能够有效扩增和检测起始模板拷贝数为1的系统都达到了灵敏度的极限。PCR效率是决定反应灵敏度的关键因素。在检测极低拷贝数时的另一个重要的考虑因素是，低拷贝时的模板数量不能按普通情况来预期。相反，它会遵循泊松分布，即进行大量的平行重复，平均应该含有一个拷贝的起始模板，实际上约37%不含有拷贝，仅有约37%含有1个拷贝，约18%实际上含有两个拷贝。因此，为了更可靠地检测低拷贝，必须做大量的平行重复实验来提供统计显著性，并克服泊松分布的限制。 评价荧光PCR结果的标准

因素 建议 指标

效率 5个数量级梯度稀释 Slope～-3.3 R2>0.99

精密度 至少3个重复 标准差<0.25（0.5或者1个Ct之内）

灵敏度 增加低浓度样本的重复数 统计分析

除了这些因素，还必须评估和验证合适的实验对照（如无模板对照，无 反转录酶对照等）以及模板质量。

3. Real-time qPCR定量方法

可以分绝对定量和相对定量。绝对定量是用一系列已知浓度的标准品制作标准曲线，在相同的条件下目的基因测得的荧光信号量同标准曲线进行比较，从而得到目的基因的量。该标准品可以是纯化的质粒DNA，体外转录的RNA，或者是体外合成的ssDNA。相对定量可以分比较Ct法和其他一些相对方法。比较Ct指的是通过与内参基因Ct值之间的相差来计算基因表达差异,也称之是2-△△Ct。

3.1 绝对定量

3.2 2-△△Ct定量

3.3 其他定量方法

Marisa L. Wong and Juan F. Medrano: BioTechniques July 2005

六、Real-Time qPCR常见问题分析

1.无Ct值出现


检测荧光信号的步骤有误: 一般SG法采用72℃延伸时采集，Taqman法则一般在退火结束时或延伸结束采集信号。


引物或探针降解: 可通过PAGE电泳检测其完整性。


模板量不足: 对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起。


模板降解: 避免样品制备中杂质的引入及反复冻融的情况。

2. Ct值出现过晚（Ct>38）


扩增效率低: 反应条件不够优化。设计更好的引物或探针；改用三步法进行反应；适当降低退火温度；增加镁离子浓度等。


PCR各种反应成分的降解或加样量的不足。


PCR产物太长: 一般采用80-150bp的产物长度。

3. 标准曲线线性关系不佳


加样存在误差: 使得标准品不呈梯度。


标准品出现降解: 应避免标准品反复冻融，或重新制备并稀释标准品。


引物或探针不佳: 重新设计更好的引物和探针。


模板中存在抑制物，或模板浓度过高

4. 负对照有信号


引物设计不够优化：应避免引物二聚体和发夹结构的出现。


引物浓度不佳：适当降低引物的浓度，并注意上下游引物的浓度配比。


镁离子浓度过高：适当降低镁离子浓度，或选择更合适的mix试剂盒。


模板有基因组的污染：RNA提取过程中避免基因组DNA的引入，或通过引物设计避免非特异扩增。

5. 溶解曲线不止一个主峰


引物设计不够优化：应避免引物二聚体和发夹结构的出现。


引物浓度不佳：适当降低引物的浓度，并注意上下游引物的浓度配比。


镁离子浓度过高：适当降低镁离子浓度，或选择更合适的 mix 试剂盒。


模板有基因组的污染：RNA提取过程中避免基因组DNA的引入，或通过引物设计避免非特异扩增。

6. 扩增效率低


反应试剂中部分成分特别是荧光染料降解。


反应条件不够优化：可适当降低退火温度或改为三步扩增法。


反应体系中有PCR反应抑制物：一般是加入模板时所引入，应先把模板适度稀释，再加入反应体系中，减少抑制物的影响。

7. 同一试剂在不同仪器上产生不同的曲线，如何判断？

判断标准：扩增效率，灵敏度，特异性

如果扩增效率在90%-110%，都是特异性扩增，都可以把数据用于分析。

8. 扩增曲线的异常？比如“S”型曲线？


参比染料设定不正确(MasterMix不加参比染料时，选NONE)


模板的浓度太高或者降解


荧光染料的降解