【分享】QPCR常见问题及其分析

一般来讲，进行real-time qPCR MasterMix都是2×的浓缩液，只需要加入模板和引物就可以。由于real-time qPCR灵敏度高，所以每个样品至少要做3个平行孔，以防在后面的数据分析中，由于Ct相差较多或者SD太大，无法进行统计分析。

通常来讲，反应体系的引物终浓度为100-400mM；模板如果是总RNA一般是10ng-500，如果cDNA，通常情况下是1ul或者1ul的10倍稀释液，要根据目的基因的表达丰度进行调整。

当然这些都是经验值，在操作过程中，还需要根据所用MasterMix，模板和引物的不同进行优化，达到一个最佳反应体系。在反应体系配置过程中，有下面几点需要注意：

1. MasterMix不要反复冻融，如果经常使用，最好溶解后放在4度。

2. 更多的配制Mix进行，减少加样误差。最好能在冰上操作。

3. 每管或每孔都要换新枪头！不要连续用同一个枪头加样！

4. 所有成分加完后，离心去除气泡。

5. 每个样品至少3个平行孔。

参比或者校正染料（reference dye，passive dye）常用的是ROXTM（现在已经是ABI的注册商标了！）或者其他染料，只要不影响检测PCR产物的荧光值就可以。参比染料的作用是标准化荧光定量反应中的非PCR震荡，校正加样误差或者是孔与孔之间的误差，提供一个稳定的基线。

现在很多公司已经把ROXTM配制在MasterMix或者Premixture里。如果反应曲线良好或已经优化好反应体系，也可以不加ROXTM染料校正。

通常来讲，real-time qPCR的反应程序不需要像常规的PCR那样，要变性、退火、延伸3步。由于其产物长度在80-150bp 之间，所以只需要变性和退火就可以了。

SYBR@Green等染料法，最好在PCR扩增程序结束后，加一个溶解程序，来形成溶解曲线，判断PCR产物的特异性扩增。而溶解程序，仪器都有默认设置，或稍有不同，但都是一个在产物进行溶解时候，进行荧光信号的收集。

所有仪器的操作都基本一致。设置的时候包括反应板设置（plate setup）和程序设置（program setup）。我们以 ABI StepOne为例，详细看一下反应设置：

A. 首先是实验目的选择：定量还是其他。我们命名为“BioTeke”，进行“定量”实验。

B. 实验方法的选择：我们选用的比较Ct的SYBR Green方法， Fast程序，以cDNA为模板进行。

C. 目的基因的设置：有几个目的基因和目的基因的名称。

D. 样品的设置：包括哪个是实验组，哪个是对照组。以及负对照的设置和生物重复的设置。

E. 对照组和内参基因的设置：这个是为后面的定量做准备

F. 反应程序的设置：PCR反应程序的设置要根据不同公司的MasterMix。比如BioTeke的95℃ 2分钟就可以激活DNA聚合酶（ABI的需要10 分钟）。循环反应是95℃15秒，60℃15秒的40个循环。溶解曲线程序采用仪器默认设置就可以。或者是仪器说明书上建议的程序。

G. 反应体系的设置：

A-G这五个步骤简单设置好，可以保存，修改反应程序或者立刻进行反应。

需要注意一点ABI仪器需要加ROX参比染料，默认的是ROX。有些公司是把ROX或者其他染料配制在MasteMix里面；也有的是单独分开。要根据不同公司的MasterMix进行这一个步骤的选择。BioTeke的MasterMix里没有参比染料，所以选择“none”。

设置好之后，就可以把配置好的PCR管放进仪器，点击RUN！

一、Real-time qPCR数据分析

1. Real-time qPCR常见参数

基线（baseline）

通常是3-15个循环的荧光信号

同一次反应中针对不同的基因需单独设置基线

阈值（threshold）

自动设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍

手动设置：置于指数扩增期，刚好可以清楚地看到荧光信号明显增强。

同一次反应中针对不同的基因可单独设置阈值，但对于同一个基因扩增一定要用同一个阈值。

Ct值:与起始浓度的对数成线性关系。

分析定量时候一般取Ct:15-35。太大或者太小都会导致定量的不准确。

Rn（Normalized reporter）是荧光报告基团的荧光发射强度与参比染料的荧光发射强度的比值。

△Rn：△Rn是Rn扣除基线后得到的标准化结果（△Rn=Rn-基线）。

2.影响Ct值的关键因素

模板浓度

模板浓度是决定Ct的最主要因素。控制在一个合适范围内，使Ct在15-35之间。

反应液成分的影响

任何分子的荧光发射都受环境因素影响----比如溶液的pH值和盐浓度。

PCR反应的效率

PCR反应的效率也会影响Ct值。在PCR扩增效率低的条件下进行连续梯度稀释扩增，与PCR扩增效率高的条件下相比，可能会所产生斜率不同的标准曲线。PCR效率取决于实验、反应混合液性能和样品质量。一般说来，反应效率在90-110%之间都是可以接受的。

3. 如何评估实时定量PCR反应的效果

PCR扩增效率：为了正确地评估PCR扩增效率，至少需要做3次平行重复，至少做5个数量级倍数(5logs)连续梯度稀释模板浓度。

常见问题

1. 无Ct值出现

检测荧光信号的步骤有误: 一般SG法采用72℃延伸时采集，Taqman法则一般在退火结束时或延伸结束采集信号。

引物或探针降解: 可通过PAGE电泳检测其完整性。

模板量不足: 对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起。

模板降解: 避免样品制备中杂质的引入及反复冻融的情况。

2. Ct值出现过晚（Ct>38）

扩增效率低: 反应条件不够优化。设计更好的引物或探针；改用三步法进行反应；适当降低退火温度；增加镁离子浓度等。

PCR各种反应成分的降解或加样量的不足。

PCR产物太长: 一般采用80-150bp的产物长度。

3. 标准曲线线性关系不佳

加样存在误差: 使得标准品不呈梯度。

标准品出现降解: 应避免标准品反复冻融，或重新制备并稀释标准品。

引物或探针不佳: 重新设计更好的引物和探针。

模板中存在抑制物，或模板浓度过高

4. 负对照有信号

引物设计不够优化：应避免引物二聚体和发夹结构的出现。

引物浓度不佳：适当降低引物的浓度，并注意上下游引物的浓度配比。

镁离子浓度过高：适当降低镁离子浓度，或选择更合适的mix试剂盒。

模板有基因组的污染：RNA提取过程中避免基因组DNA的引入，或通过引物设计避免非特异扩增。

5. 溶解曲线不止一个主峰

引物设计不够优化：应避免引物二聚体和发夹结构的出现。

引物浓度不佳：适当降低引物的浓度，并注意上下游引物的浓度配比。

镁离子浓度过高：适当降低镁离子浓度，或选择更合适的 mix 试剂盒。

模板有基因组的污染：RNA提取过程中避免基因组DNA的引入，或通过引物设计避免非特异扩增。

6. 扩增效率低

反应试剂中部分成分特别是荧光染料降解。

反应条件不够优化：可适当降低退火温度或改为三步扩增法。

反应体系中有PCR反应抑制物：一般是加入模板时所引入，应先把模板适度稀释，再加入反应体系中，减少抑制物的影响。

7. 同一试剂在不同仪器上产生不同的曲线，如何判断？

判断标准：扩增效率，灵敏度，特异性

如果扩增效率在90%-110%，都是特异性扩增，都可以把数据用于分析。

8. 扩增曲线的异常？比如“S”型曲线？

参比染料设定不正确(MasterMix不加参比染料时，选NONE)

模板的浓度太高或者降解

荧光染料的降解

荧光定量PCR问题汇总

1. 定量PCR仪的开关机顺序是怎样的？

　　按照正确的开关机顺序操作，有助于延长仪器的使用寿命，减少仪器出故障的频率。

　　开机顺序：先开电脑，待电脑完全启动后再开启定量PCR仪主机，等主机面板上的绿灯亮后即可打开定量PCR的收集软件，进行实验。

　　关机顺序：确认实验已经结束后，首先关闭信号收集软件，然后关掉定量PCR仪主机的电源，最后关闭电脑。

2. 哪些种类的反应管和盖子适合定量PCR实验使用？有何需要注意的地方？ 　　

　　定量PCR实验可以使用以下耗材：96孔光学反应板配合光学膜，0.2 ml光学八联反应管配合光学膜，0.2 ml光学八联反应管配合平盖的光学八联管盖。ABI公司生产的定量PCR耗材的具体使用方法和货号见下表：

3. 为什么要定期对电脑进行磁盘碎片整理？怎样整理？

　　当运行实时定量PCR仪及使用软件分析实验结果时，计算机会删除并创建若干文件，计算机硬盘的空闲空间会被分割成越来越多的小块。当硬盘驱动器上文件以分解的碎片存储时，程序需要更长的时间才能存取文件，因为必须多次寻找文件碎片以存取不同的片断。

碎片整理实用程序将一个文件分解开的多个碎片合并在一起，并存储到硬盘的同一个位置，从而清除文件碎片，进而优化系统性能。

碎片整理的方法如下：

　　· 在Windows桌面上，选择开始(start)，我的电脑(My computer)。

　　· 在(我的电脑)窗口中，用鼠标右键单击硬盘驱动器，并选择(属性)property。

　　· 在(属性)对话框中选择工具(Tools)选项卡，单击开始整理(Defragment now)。

　　· 单击碎片整理(Defragment)。

　　· 当显示“碎片整理完毕”对话框时，单击（确定）。

　　· 在“本地磁盘属性”对话框中，单击（确定）。

　　· 为计算机机中剩余的驱动器重复如上步骤。

4. 何时执行windows service pack更新？

　　不要执行该操作。除非美国应用生物系统公司代表通知您更新操作系统，否则请不要更新控制定量PCR 仪的计算机的操作系统。新版本的Microsoft Windows操作系统有可能与SDS 软件存在冲突，并导致仪器不能正常运行。如果您希望安装service pack（更新包）以更新操作系统，应查看随SDS 软件提供的版本说明，避免兼容性问题。

5. 应该备份哪些数据？

　　应该定期备份您的实验数据，备份频率推荐每周一次，用光盘刻录。同时您也应该备份定量PCR仪的各种纯荧光光谱校正文件、背景文件和安装验证实验数据。

6.怎么样的实验室环境才能保证仪器设备正常运行？

　　良好的实验室环境有助于延长仪器的使用寿命，减少仪器出故障的频率。推荐做到以下几个方面：

　　电源：推荐配备合适的UPS或稳压器。

　　通风：仪器的通风应该没有阻挡。

　　温度：推荐实验室配备空调，温度应该控制在10-30°C之间。

　　湿度：20-80%；对于潮湿的省份，推荐实验室配备除湿机。

　　空间：易于操作，安全。

7. 怎样判断定量pcr仪的样本加热块是否被污染？怎样清除污染？

　　一个办法是运行背景校正反应板，当一个或多个反应孔连续显示出不正常的高信号，则表明该孔可能被荧光污染物。

　　另外一种办法是在不放任何物品到样本块上的前提下，执行ROI的校正，当某个孔的信号明显高出其他孔时，则表明该孔被污染。

清除样本加热块污染的步骤如下：

　　用移液器吸取少量乙醇并滴入每个污染的反应孔中。

　　吹打数次。

　　将废液吸入废液杯中。

　　重复以上步骤：乙醇三次，去离子水三次。

　　确认反应孔中的残留液体蒸发完。

8. 什么是背景校正？多长时间执行一次背景校正？

　　背景校正程序测量定量PCR仪所使用的反应管和水的空白荧光强度。在运行校正程序期间，定量PCR仪在10分钟内连续读取背景校正板的荧光强度，信号收集的温度为60°C。随后，SDS软件计算所收集到的荧光强度的平均值，提取结果并保存到校正文件中。软件在今后的分析中将自动调用此校正文件，从实验数据中扣除背景信号。

　　因为背景荧光的信号强度随着许多外界因素（比如外来的污染、反应板/反应管的生产厂商不同、水的纯度等）而变化，所以推荐定期进行背景校正，一般每三个月到半年校正一次。

9. 什么是纯荧光校正？多长时间校正一次？

　纯荧光校正是测定各种纯荧光染料标准品的波长和信号强度，通俗地说是让仪器“认识”各种荧光染料。软件收集并储存各种纯荧光染料标准品的荧光信息。

以后每次定量实验运行过程中，SDS软件收集样品的原始光谱信号，并将此原始光谱与纯荧光文件中的数据进行比较，精确扣除不同染料的信号重叠部分，从而确定样品中的荧光染料种类和信号强度。

　　推荐每半年进行一次纯荧光校正。在运行光谱校正之前，请先进行背景校正和ROI校正。

10.96孔板怎样封膜？

　　当使用96孔板做实验的时候，推荐使用光学膜代替盖子来密封反应孔。正确的封膜方法是：先沿着96孔板的纵向压膜，然后横向，最后沿着板的边缘按压使之密封。

11.使用单管或8连管做实验时，在样品加热块上应该怎样安排放置？

　　使用单管或8连管做实验，并且样本数量不多的时候，建议在样品加热块(TRAY)上对称地安放样品，最好是纵向放置，并且优先放在第6列或第7列，然后逐渐向两边放置。这样做的好处是热盖压下来的时候不至于发生倾斜，各个反应管的受力和受热都比较均匀，提高孔与孔之间的数据精密性.

12. 绝对定量与相对定量有什么区别？

　　绝对定量的目的是测定目的基因在样本中的分子数目，即通常所说的拷贝数。相对定量的目的是测定目的基因在两个或多个样本中的含量的相对比例，而不需要知道它们在每个样本中的拷贝数。

　　举例来说，如果研究项目中包括处理过的和未经处理的对照样本，通常可以将未经处理的样本指定为基准，规定其目的基因浓度为100%，将经处理的样本的定量结果除以对照样品的定量结果，就可以计算各个处理样本的基因含量相对于未处理样品的百分比。

　　绝对定量实验必须使用已知拷贝数的绝对标准品，必须做标准曲线。相对定量可以做标准曲线，也可以不做标准曲线。

　　相对定量实验有两种方法：标准曲线法和CT值比较法。如果使用标准曲线法，可以使用绝对标准品，也可以使用相对标准品，而且相对标准品在实验操作上更为简便易行。相对标准品是只知道样品中DNA或RNA的稀释比例而不需要知道其分子数目的标准品，典型的做法是将一个已知pg数的样品做一系列梯度稀释。

　　 CT值比较法是利用CT值与起始DNA浓度的对数成反比的数学关系，来计算不同样本之间的相对百分比，其计算公式是。

　　绝对定量的数据易于理解，但是绝对标准品的制备和测定其DNA含量比较困难。有许多商业性的标准品试剂盒供选购，可以解决这种困难。

　　相对定量的标准品容易在实验室里自己制备，但是数据处理比较麻烦，对实验数据的解释有一定难度。

13. 定量PCR基因表达的实验数据应该如何处理？

　　总的来说，有三个层次的校正是必须要做的。

　　首先，参比信号校正。试剂中必须包含固定浓度的ROX，这样由于反应总体积的差异、所在孔的位置不同、试管壁的厚度差异、管盖透光性能的差异等所引起的荧光信号波动都能够被扣除，使数据真正反映PCR进程。ROX校正能够极大地改进定量的精确度，提高重复管之间的数据重现性。

　　其次，内对照校正。实验中加入样品基本上都是以体积为单位的，但是同样体积的不同样品很可能来自不同数目的细胞，所以将实验结果校正到每个细胞的含量是必要的。方法是在定量目的基因（如IL-2）的同时定量一个内对照基因（如18S RNA基因），然后IL-2/18S。内对照校正使不同样品的实验数据可以相互比较。

　　第三，计算相对于基准样品(Calibrator)的相对基因含量。比如研究处理和未处理的、0小时和6小时的、正常和患病的之间的基因表达的差别，则需要计算处理/未处理、6小时/0小时、患病/正常。

14. 标准曲线法相对定量的数据应该怎么处理？

　　假设实验的目标是研究药物处理后0、24、48小时IL-2基因在某种组织中的表达量的变化，所用的内对照是18S RNA基因。IL-2和18S RNA的测定结果都是总RNA的pg数，数据的处理方法见下表：

15.什么是CT值比较法？数据怎么处理？

　　CT值与起始DNA浓度的对数成反比：

　　如果(1)不同管之间的PCR反应效率相同；(2)这些PCR的反应效率接近100%，可以从上面的公式推出相对含量(X01/X02) = 2 -ΔΔCT。假设实验的目标是研究药物处理后0、24、48小时IL-2基因在某种组织中的表达量的变化，所用内对照是18S RNA基因。IL-2和18S RNA的测定结果都是CT值，而没有通过标准曲线测定总RNA的pg数。　　　　　

16. 每个反应管中可以加入多少种探针？

　 每个反应管中可以加入的探针数目，取决于仪器、软件、试剂和实验设计等几个方面。

　　首先是仪器的硬件构成和软件的解析能力。在软件解析能力足够的前提下，全波长检测的定量PCR仪如激光管-CCD类型对于探针的数量实际上是没有限制的。如果信号的采集要通过滤色片，那么探针的数量取决于滤色片的数目，增加探针需要增加或改变滤色片。

改动仪器的结构通常很困难。以AB公司的仪器为例，7900和7700是激光-全波长检测的，7000、7300是4色滤色片的，7500是5色滤色片的。

　　其次是化学上的可能性。不同的荧光基团要组合到一起，在同一反应管内使用，必须其激发波长既相对靠近又不能靠得太近，既保证信号激发的效率又保证信号不重叠干扰，能够区分清楚。现已发现的荧光基团种类有限，满足这样条件的分子组合更少。目前的最佳组合只能达到每组4到5种荧光的水平。

　　第三是实验方案的设计和选用的探针类型。定量PCR实验必须使用ROX校正荧光，占去一种荧光；TaqMan探针的淬灭基团(TAMRA)也要占用一种荧光，对于4色检测的仪器来说，只剩下2种荧光可以标记探针，对于5色检测的仪器还有3种荧光可以使用。

如果将探针改用TaqMan MGB探针，由于它的淬灭基团是不发荧光的，比之TaqMan探针就可以多1种荧光用于标记探针。如果实验要求不高，不做ROX校正（AB公司不推荐这样做），还可以再多一种荧光用于标记探针。

　　第四是研究应用本身的要求。如果研究SNP和基因突变，因为绝大多数人类基因是2态的，只存在两种等位基因，2条探针已经足够。如果研究基因表达，通常是两两比较居多，比如处理比未处理，正常比异常等，加上一个内对照，3色也就足够了。

　　最后是成本控制方面的要求。多重定量的目的一是提高数据精确度，二是节省反应成本。同时测定的基因越多，成本也越低。但是加入4-5种探针，就要同时加入8-10条引物。

在引物设计的时候要考虑到尽量减少这些引物之间的竞争和抑制等多种干扰，平衡各对引物之间的PCR效率。虽然这是可以做到的，但是要花费大量时间、人力和物力来筛选最佳引物组合、优化反应条件。如果实验规模不大，在总体上可能反而不合算。

　　在实际应用中，不是单纯追求加入的探针越多越好，而是追求总体效益的最优化。比较切合实际的是2到3重反应，引物和探针的设计不太困难，反应条件的优化也不太麻烦，同时降低了成本。

17. 等位基因鉴定实验（比如SNP分型）是定性的研究，是否可以不进行ROX荧光校正？

不，等位基因鉴定实验也要进行ROX荧光归一，以保证实验结果的精密可靠。

　　由于试剂加样操作的误差、离心管热量传递的误差、离心管盖透光性能的误差等偶然因素是不可避免的，必然导致荧光激发效率的差异，因此仪器收集到的原始信号必须进行归一化校正，相互之间才可以比较并保证重现性。

　　这种校正是通过在反应缓冲液中添加ROX校正荧光来实现的。ROX在反应缓冲液中的浓度是固定的，因此其信号的高低变化只与上述物理方面变化的总体效应有关。将报告荧光的信号除以ROX荧光的信号，就能够消除所有这些物理因素所引起的数据波动。

18. 内标法和外标法哪种数据更精密？

是同样可靠的。内标的优点在于目标基因与管家基因的反应条件最接近一致，缺点在于目标基因与管家基因的引物和探针相互之间会发生竞争与抑制，导致它们的PCR效率有差异。

外标的优点在于目标基因与管家基因的引物和探针之间没有发生竞争与抑制的机会，但是不同管之间的反应条件差异比同管的要大，也会导致它们的PCR效率有差异。两相比较，内标法与外标法的数据精确度是一样的。