丁香实验_LOGO
登录
提问
提问
我要登录
|免费注册
点赞
收藏
wx-share
分享

研究蛋白质与 DNA 相互作用的主要方法

丁香实验

1182

一、引言

在许多的细胞生命活动中,例如 DNA 复制、mRNA 转录与修饰以及病毒的感染等都涉及到 DNA 与蛋白质之间的相互作用的问题。

重组 DNA 技术的发展,人们已分离到了许多重要的基因。现在的关键问题是需要揭示环境因子及发育信号究竟是如何控制基因的转录活性。为此需要:

1. 鉴定分析参与基因表达调控的 DNA 元件。

2. 分离并鉴定这些顺式元件特异性结合的蛋白质因子。

这些问题的研究都涉及到 DNA 与蛋白质之间的相互作用。

研究 DNA-蛋白质相互作用的实验方法主要包括:

1. 凝胶阻滞实验。

2. DNase1 足迹实验。

3. 甲基化干扰实验。

4. 体内足迹实验。

5. 拉下实验。

二、凝胶阻滞实验

1. 概念:

凝胶阻滞实验(Gelretardationassay),要叫做 DNA 迁移率变动试验(DNAmobilityshiftassay)或条带阻滞实验(Bandretardationassay)是在八十年代初期出现的用于在体外研究 DNA 与蛋白质相互作用的一种特殊的凝胶电泳技术。

2. 原理:

在凝胶电泳中,由于电场的作用,裸露的 DNA 分子向正电极移动距离的大小是同其分子量的对数成反比。如果某种 DNA 分子结合上一种特殊的蛋白质,那么由于分子量的加大它在凝胶中的迁移作用便会受到阻滞,于是朝正极移动的距离也就相应的缩短,因而在凝胶中出现滞后的条带,这就是凝胶阻滞实验的基本原理。

3. 过程:

首先制备细胞蛋白质提取物(理论上其中含有某种特殊的转录因子)

用放射性同位素标记待检测的 DNA 片段(含有转录因子的结合位点)

这种被标记的探针 DNA 同细胞蛋白质提取物一起进行温育,于是产生DNA -蛋白质复合物,在控制使 DNA -蛋白质保持结合状态的条件下,进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,最后进行放射自显影,分析电泳结果。

4. 实验结果的分析:

(1)如果有放射性标记的条带都集中于凝胶的底部,这就表明在细胞提取物中不存在可以同探针 DNA 相互结合的转录因子蛋白质.

(2)如果在凝胶的顶部出现放射性标记的条带,这就表明细胞提取物存在可与探针 DNA 结合的转录因子蛋白质。

5. DNA 竞争实验:

DNA 竞争实验(DNAcompetitiveassay)的具体做法如下:

在 DNA-蛋白质结合的反应体系中加入了超量的非标记的竞争 DNA(competitorDNA),如果它同探针 DNA 结合的是同一种转录因子蛋白质,那么由于竞争 DNA 与探针 DNA 相比是极大超量的,这样绝大部分转录因子蛋白质都会被竞争结合掉,而使探针 DNA 仍然处于自由的非结合状态,可以在电泳凝胶的放射自显影图片上就不会出现阻滞的条带。

如果反应体系中加入的竞争 DNA 并不能同探针 DNA 竞争结合同一种转录因子,结果在电泳凝胶中的放射自显影图片上就会出现阻滞的条带。

6. 应用:

(1)凝胶阻滞实验可以用于鉴定在特殊类型细胞蛋白质提取物中,是否存在能同某一特定的 DNA(含有转录因子结合位点)结合的转录因子蛋白质;

(2)DNA 竞争实验可以用来检测转录因子蛋白质同 DNA 结合的精确序列部位;

(3)通过竞争 DNA 中转录因子结合位点的碱基突变可以研究此种突变竞争性能及其转录因子结合作用的影响;

(4)也可以利用 DNA 同特定转录因子的结合作用通过亲和层析来分离特定的转录因子。

三、足迹实验

1. 定义:

足迹实验(foot-printingassay),是一种用来检测被特定转录因子蛋白质特异性结合的DNA序列的位置及其核苷酸序列结构的专门实验方法。

2. 原理:

当DNA分子中的某一区段同特异的转录因子结合之后便可以得到保护而免受DNaseI酶的切割作用,而不会产生出相应的切割分子,结果在凝胶电泳放射性自显影图片上便出现了一个空白区,俗称为“足迹”。

3. 过程:

将待检测的双链 DNA 分子在体外用 32P 作 5‘ 末端标记,并用适当的限制性内切酶切出其中的一个末端,于是便得到了一条单链末端标记的双链 DNA 在体外同细胞蛋白质提取物(细胞核提取物也可以)混合,形成 DNA -蛋白质复合体在反应混合物中加入少量的 DNaseI,并控制用量使之达到平均每条 DNA 链,只发生一次磷酸二酯键的断裂:

(1)如果蛋白质提取物中不存在与 DNA 结合的特定蛋白质,使DNaseI 消化之后,便会产生出距离放射性标记末端1个核苷酸,2个核苷酸,3 个核苷酸------等等一系列前后长度均相差一个核苷酸的不间断的连续的 DNA 片段梯度群体.

(2)如果 DNA 分子同蛋白质提取物中的某种转录因子结合,被结合部位的 DNA 就可以得到保护免受 DNaseI 酶的降解作用。

除去蛋白,加样在 20% 序列胶上进行电泳分离,实验分两组:

实验组:DNA+ 蛋白质混合物

对照组:只有 DNA,未与蛋白质提取物进行温育

最后进行放射性自显影,分析实验结果。

4. 结果判断:

实验组凝胶电泳显示的序列,出现空白的区域表明是转录因子蛋白质结合部;与对照组序列比较,便可以得出蛋白质结合部位的 DNA 区段相应的核苷酸序列。

5. 其他的足迹实验方法:

除了 DNase1 足迹试验之外,目前还发展出了若干种其他类型的足迹实验,例如:

a. 自由羟基足迹实验;b、菲咯啉铜足迹实验;c、DMS(硫酸二甲酯)足迹实验

DMS(硫酸二甲酯)足迹实验的原理

DMS 能够使 DNA 分子中裸露的鸟嘌呤(G)残基甲基化,而六氢吡啶又会对甲基化的 G 残基作特异性的化学切割。如果 DNA 分子中某一区段同转录因子结合,就可以避免发生 G 残基的甲基化而免受六氢吡啶的切割作用。

四、甲基化干扰实验

1. 概念:

甲基化干扰实验(Methylationinterferenceassay)是根据 DMS(硫酸二甲酯)能够使 DNA 分子中裸露的鸟嘌呤(G)残基甲基化,而六氢吡啶又会对甲基化的 G 残基作特异性的化学切割这一原理设计的另一种研究蛋白质同 DNA 相互作用的实验方法。

应用这种技术可以检测靶 DNA 中 G 残基的优先甲基化,对尔后的蛋白质结合作用究竟会有什么效应,从而更加详细的揭示出 DNA 与蛋白质相互作用的模式。

2. 实验步骤:

用 DMS 处理靶 DNA 使之局部甲基化(平均每条 DNA 只发生一个 G 碱基甲基化作用)同细胞蛋白质提取物一起进行温育,促进使 DNA 与蛋白质的结合

进行凝胶电泳形成两种靶 DNA 条带:

(1)其一没有同蛋白质结合的 DNA 正常电泳条带

(2)其二同特异蛋白质结合而呈现滞后的 DNA 电泳条带

将这两种 DNA 电泳条带分别从凝胶中切出,并用六氢吡啶进行切割,结果为:

(1)甲基化的 G 残基被切割:因为转录因子蛋白质只能够同未发生甲基化的正常的结合位点结合,所以在转录因子 DNA 结合位点序列中的 G残基如果被 DMS 甲。

(2)不具有甲基化 G 残基的靶 DNA 序列则不会被切割将结合蛋白质的DNA条带和不结合蛋白质的 DNA 条带,经六氢吡啶切割作用之后,再进行凝胶电泳。作放射自显影,读片并分析结果

3. 结果判断:

(1)同转录因子蛋白质结合的靶 DNA 序列,经六氢吡啶切割之后,电泳分离呈现两条带,有一个空白区。

(2)不同转录因子蛋白质结合的靶 DNA 序列,经六氢吡啶切割后,电泳分离呈现三条带,没有空白区域的出现。

4. 应用:

(1)甲基化干扰实验可以用来研究转录因子与 DNA 结合位点中的 G 残基之间的联系。

(2)是足迹实验的一种有效的补充手段,可以鉴定足迹实验中 DNA 与蛋白质相互作用的精确位置。

5、缺点:

DMS 只能使 DNA 序列中的 G 和 A 残基甲基化,而不能使 T 和 C 残基甲基化。

五、体内足迹实验

上面讨论的三种研究转录因子与 DNA 相互作用的方法,有一个共同的不足之处在于它们是在体外进行的实验,因此人们就会考虑这些实验结果是否能够反映细胞内发生的真实生命过程,即细胞内发生的真实的 DNA 与蛋白质的相互作用情况。

为了解答这个问题,科学家就设计出了一种体内足迹试验(invivofoot-printingassay),该方法可以看做是体外 DMS 足迹实验的一个变种。

1. 原理:

体内足迹试验的原理原则上同体外DMS足迹实验无本质差别,即

(1)DMS能够使G残基甲基化。

(2)六氢吡啶能特异的切割甲基化的G残基。

(3)同特异转录因子蛋白质结合的识别序列中的G残基由于受到蛋白质的保护而不会被DMS甲基化,于是不会被六氢吡啶切割。

(4)同对照的裸露的DNA形成的序列梯作比较,就会发现活细胞DNA形成的序列梯中缺少G残基没有被切割的相应条带。

2. 过程:

用有限数量的化学试剂 DMS 处理完整的游离细胞,使渗透到胞内的DMS 浓度恰好导致天然染色体 DNA 的 G 残基发生甲基化。

对这些经过 DMS 处理的细胞提取 DNA,并在体外加入六氢吡啶作消化反应。

PCR 扩增后作凝胶电泳分析,因为在体外实验中用的是克隆的 DNA 片段其数量足够,而在体内足迹实验中用的是从染色体 DNA 中分离获得的任何一种特异的 DNA,其数量是微不足道的,所以需要经 PCR 扩增以获得足够数量的特异 DNA 放射自显影,读片并记录读片的结果

3. 结果判断:

(1)能够同转录因子蛋白质结合的 DNA 区段其中 G 残基受到保护因而不会被 DMS 甲基化避免了六氢吡啶的切割作用;

(2)体外裸露的 DNA 分子上,G 残基被 DMS 甲基化而被六氢吡啶切割。

六、拉下实验(Pull-downassay)

拉下实验又叫做蛋白质体外结合实验(bindingassayinvitro),是一种在试管中检测蛋白质之间相互作用的方法。其基本原理是将某种小肽(例如生物素、6-His标签以及谷胱甘肽转移酶等)的编码基因与诱饵蛋白的编码基因重组,表达为融合蛋白。

分离纯化融合蛋白并与磁珠结合,使之固相化之后,再与表达目的蛋白的细胞提取物混合保温适当时间,例如在 4℃ 下保温过夜,使目标蛋白同已经固定在磁珠表面的融合蛋白中的诱饵蛋白充分的结合。

离心收集与固定化的融合蛋白(即与磁珠相互结合的融合蛋白)中的诱饵蛋白相结合的目的蛋白,经过煮沸处理使目的蛋白与诱饵蛋白相脱离从而从固相支持物(例如磁珠)上脱离下来,收集样品,再与目标蛋白的抗体作 Westernblotting 分析,以检测出与诱饵蛋白的目标的目标蛋白。

提问
扫一扫
丁香实验小程序二维码
实验小助手
丁香实验公众号二维码
关注公众号
反馈
TOP
打开小程序