蛋白质间相互作用研究方法1

互联网2013-09-05

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确定各种可能与目标蛋白相互作用的蛋白质，“撒大网”

l 双杂交和其他双成分系统

第一阶段：诱饵 -LexA 融合蛋白的鉴定

诱饵 -LexA 融合蛋白的构建

1．将编码诱饵蛋白的靶 DNA 克隆到 LexA 融合载体的多聚接头处，以合成一种框架内的 LexA 融合基因。确定诱饵序列的羧基端存在翻译终止序列。形成的质粒作为 pBait 。

2．采用下列 LexA 融合基因和 lexAop-lacZ 报道质粒的组合，建立一系列 EGY48 lexAop-LEU2 选择的转化酵母菌：

a. pBait + pMW12 （活化测定）

b. pSH17-4 + pMW12 （活化的阳性对照）

c. pRFHM1 + pMW12 （活化的阴性对照）

d. pBait + pJK101 （抑制 /DNA 结合测定）

e. pRFHM1 + pJK101 （抑制的阳性对照）

f. pJK101 单独（抑制的阴性对照）

3．将每种转化混合物铺在适宜的选择性缺陷板上： CM(Glu)-Ura-His （针对质粒组合 a~e ）或 CM(Glu)-Ura （针对质粒组合 f ）。将培养板在 37 ℃培养 2~3 天以选择含有质粒的转化酵母克隆。

4．制备转化子的母板。

活化和抑制活性的鉴定： X-gal 和 Leu2 表型的分析

5．从 a~f 的每个转化中，用无菌的平头牙签挑选约 8 个克隆。用干净的牙签触及克隆以挑取细胞，使它们在新鲜的 CM(Glu)-Ura-His 或 CM(Glu)-Ura 平板上划 1 cm 长的线， 30 ℃孵育过夜。

6．第二天，从两个母板上再划线到下列每个板上：

转化 a~f ：划线到 CM(Glu, X-gal)-Ura 和 CM(Gal, X-gal)-Ura 上

转化 a~c ：划线到 CM(Glu)-Ura-His-Leu 和 CM(Gal)-Ura-His-Leu 上

7． 30 ℃将平板孵育到 4 天。

8．对抑制和激活性进行分析：

a. 对于抑制活性，在划线接菌 12 ～ 24 h 时观察 X-gal 表型。

b. 对于激活性，在划线接菌 18 ～ 72 h 时观察 X-gal 表型。

c. 在 48 ～ 96 h 之间观察 Leu 表型。

9．基于抑制和激活分析的结果，选择适当的候选克隆。

检测诱饵蛋白质表达

10．在母板上，标记要分析蛋白质表达的克隆。用已证实适宜表达诱饵的克隆作为基础菌培养，供文库转化用。

11．对每个新的诱饵构建，至少分析两个初级转化子。还要包括两个作为蛋白质表达阳性对照的转化子。

12．转移 1.5 ml 培养液到一个微量离心管中，在离心机上以最大速度离心细胞 3 ～ 5 min 。可见沉淀的体积 2 ～ 5 μ l 。小心倾去或吸除上清。

13．加入 50 μ l 的 2 × SDS 凝胶加样缓冲液到离心管中，快速振荡离心管以悬浮沉淀。立即将离心管放在干冰上或干冰 / 乙醇浴中。

14．将样品从干冰或 -70 ℃直接转到 100 ℃，并煮沸 5 min 。

15．将样品在冰上冷却并在离心机上以最大速度离心 5 ～ 30 秒。加 20 ～ 50 μ l 样品到 SDS 聚丙烯酰胺凝胶的每个泳道中。

16．电泳并分析产物以确定预期大小的诱饵蛋白是否以合理的水平表达。

17．为防止可能出现的问题，通过免疫印迹来分析含 LexA 融合的诱饵的酵母裂解液。

第二阶段：筛选一个相互作用子

转化文库

1．挑选一个在第一阶段的原始对照试验中状态最好的表达诱饵蛋白和 lexAop-lacZ 报道子的酵母菌落，接种于 20 ml CM(Glu)-Ura-His 液体培养基中， 30 ℃摇动过夜培养。

2．稀释 20 ml 的过夜培养物于 300 ml 的 CM(Glu)-Ura-His 液体培养基中至 OD₆₀₀ 约为 0.10 ～ 0.15 。在旋转摇床上 30 ℃摇动培养，直到 OD₆₀₀ 达到 0.50 左右。

3．把培养物转移至 1 个 250 ml 的无菌离心瓶中，室温下 1000 ～ 1500g （使用 Sorvall GSA 转子 2500 ～ 3000 r/min ）离心 5 min 。移去上清，加入 30 ml 无菌水，在工作台上轻轻拍打离心瓶重新悬浮沉淀，转移混合物至 1 个 50 ml 的无菌 Falcon 管中。

4． 1000 ～ 1500 g （同上）离心酵母细胞 5 min 。倒掉水，重新悬浮酵母细胞于 1.5 ml 含 0.1 mol/L 乙酸锂的 TE(pH 7.5) 中。

5．在 30 个 1.5 ml 的无菌小离心管中分别加入 1 μ g 的文库 DNA 和 50 μ g 刚刚变形的载体 DNA 。马上在每个小离心管中加入 50 μ l 的酵母悬浮液。

6．在每管细胞悬浮液中加入 300 μ l 含 40% PEG4000 和 0.1 mol/L 乙酸锂的无菌 TE(pH 7.5) ，混合（不要振荡）， 30 ℃培养 30 ～ 60 min 。

7．每个试管中加入 40 μ l DMSO ，翻转混匀悬浮液，在 42 ℃的加热块上加热 10 min 。

8．转化混合物铺平板：

其中的 28 管用于产生转化子：把每管混合物加到 24cm × 24cm 的 CM(Glu)-Ura-His-Trp 选择平板上，将细胞涂匀，将板 30 ℃孵育至菌落出现。

剩余 2 管：每管取 350 μ l 混合物加到 24cm × 24cm 的 CM(Glu)-Ura-His-Trp 选择平板上， 30 ℃培养平板至出现菌落；吸取每管剩余的 40 μ l 混合物用无菌的 TE(pH7.5) 或水做一系列的 1 ： 10 稀释，每份稀释液取 100 μ l 取在 100 mm CM(Glu)-Ura-His-Trp 平板上， 30 ℃培养平板至出现菌落。

初级转化子的收获和富集

9．通过摇动法或刮擦法收获文库。

10．如果需要，在每个装有酵母细胞的锥形管中加无菌 TE （ pH7.5 ）或无菌水至 40 ～ 45 ml ，振荡或翻转试管悬浮细胞。

11．使用台式离心机 1 000~1 500g 室温下离心试管 5 min ，弃去上清。

12．重复步骤 10 和 11 。

13．重新悬浮压紧的细胞沉淀于一倍体积的无菌甘油溶液中，合并不同管的内容物，彻底混合。

14．分别转移 1 ml 的细胞混合物于一系列无菌小离心管中， -70 ℃冻存。

相互作用蛋白的筛选

15．解冻一份转化文库酵母细胞（来自步骤 14 ），用 CM(Gal-Raff)-Ura-Trp 培养基按 1 ： 10 稀释， 30 ℃摇动培养酵母细胞 4 h 来诱导文库中 GAL1 启动子的转录。

16．在适当数量的 100 mmCM(Gal-Raff)-Ura-Trp-Leu dropout 平板上分别培养 10⁶ 个细胞。

17． 30 ℃培养平板 5 天。

18．观察平板的生长，出现克隆时对其加以标记。

19．第 5 天，形成一个按每天出现的不同克隆分组的主板。

20． 30 ℃ 孵育平板直到斑点 / 菌落形成。

阳性相互作用的初次确定：β - 半乳糖苷酶活性和亮氨酸需求的检测

21．测定转录活性。

22．解释结果。

第三阶段：阳性相互作用的再次确定

阳性质粒的分离

1．从阳性菌落中制备细胞裂解物：分离少量的菌落时，将细胞在 SDS 中裂解；分离大量的菌落时，细胞用酶解酶裂解。

转化至大肠杆菌中

2．通过电穿孔的方法在感受态大肠杆菌 DH5 α 或菌 KC8 中引入 1 ～ 5 μ l 的质粒 DNA 制备品，把细菌铺在含有 50 μ g/ml 氨苄青霉素的 LB 琼脂板上， 37 ℃孵育过夜。

3．如果质粒 DNA 转入 DH5 α中，则进行步骤 4 ，如果转入 KC8 ，则：在 LB/ 氨苄青霉素瓶板上重新划线培养，或复制平板将菌落转移至细菌用基础培养基， 37 ℃孵育过夜；从一个分离的菌落制备小量的 DNA ，按步骤 2 所述利用这些 DNA 转化细菌 DH5 α 细胞。

4．从携带文库质粒的 DH5 α 细胞制备小量的 DNA 。

5．通过对含有相同插入片段的阳性克隆制备的重复样品来进行限制性酶切分析确证或确定是否重复分离到了小量的 cDNAs 。

阳性相互作用的第二次确证：重复表型和特异性检测

6．用下面的几组质粒转化酵母株 EGY48 ，在 CM(Glu)-Ura-His 平板上筛选菌落。

a. pMW112 和 pBait

b. pMW112 和 pRFHM-1

c. pMW112 和一个非特异性诱饵蛋白

7． 2 至 3 天后就可以使用由步骤 6 所得的转化酵母。使用电穿孔的方法把得自大肠杆菌 KC8 和 DH5 α 的质粒引入单个的转化子 a ～ c 中。把转化混合物铺在 CM(Glu)-Ura-His-Trp 平板上， 30 ℃孵育平板直至菌落长出。

8．为每个需要检测的文库质粒制作一块 CM(Glu)-Ura-His-Trp 主板。

9．如第 2 阶段步骤 21 所述，检测β - 半乳糖苷酶活性和亮氨酸营养缺陷型。

10．分析这些特异性检测的结果，并对所得阳性分离物进行测序。

l 用 GST 融合蛋白进行 Far Western 印迹来检测蛋白质 - 蛋白质相互作用

放射标记蛋白探针的制备

1．在微量离心管中制备下列反应混合物：

[ γ -32P] ATP （ 6000 Ci/mmol ） 5 μ l

蛋白激酶 A 1 unit/ μ l

在谷胱甘肽琼脂糖上的 GST 融合蛋白 1 ～ 3 μ g

2 × PK 缓冲液 12.5 μ l

水到 25 μ l

反应混合物在 37 ℃孵育 30 min 。

2．标记反应完成后，加入 200 μ l 的 1 × PK 缓冲液到离心管中清洗琼脂糖珠，然后在微量离心机上以最大速度离心 1 min 。用适当的方式将含游离放射性核酸的上清弃去，再重复清洗一次。

3．用一种蛋白酶切下标记蛋白质，或用 20mmol/L 还原型谷胱甘肽于 50mmol/L Tris (pH8.0) 中，将标记 GST 融合蛋白从琼脂糖珠上洗下。将标记蛋白存放在冰盒中，在同一天中使用。

4．在标记反应前如果标记蛋白与 GST 成分分开，就将标记蛋白上用 1 × PK 缓冲液平衡的 Sephadex G-50 柱，以除去游离的标记核酸。探针蛋白一旦与游离核酸分开，就可使用。将标记蛋白放在冰盒中，在同一天使用。

探测膜

5．用标准技术将蛋白质转移到膜上，制备待检测的膜。

6．用碱性缓冲液完全覆盖膜并在 4 ℃轻轻振荡清洗 10min 。

7．弃去碱性缓冲液，用封闭缓冲液完全覆盖膜，并在 4 ℃轻轻振荡孵育 4 h 过夜。

8．加入 1 ～ 3 μ g 的贮存探针（步骤 3 ， 4 ）到足够的相互作用缓冲液中，使终浓度为 1 ～ 5 nmol/L ，制备标记蛋白溶液。将膜转移到含稀释探针的平皿中，确认探针溶液与膜的整个表面均匀接触。 4 ℃轻轻振荡孵育 4 ～ 5 h 。

9．以适当的方式弃去放射性探针溶液。用磷酸缓冲盐溶液（含 0.2% Triton X-100 ）完全覆盖膜，并在 4 ℃轻轻振荡孵育 10 min 。重复洗涤 3 次。

10．用磷酸缓冲盐溶液（含 0.2% Triton X-100 和 100 mmol/L KCl ）完全覆盖膜，并在 4 ℃轻轻振荡洗涤 10 min 。重复洗涤 1 次。

11．用塑料包膜小心包裹膜并曝光到 X 光片上。