蛋白质间相互作用研究方法3：BIAcore

快速分析过去已确定的相互作用

 

l      利用 BIAcore 通过表面胞质基因共振光谱学分析相互作用的蛋白质

 

RAMc 通过伯氨基与 CM-5 传感芯片表面的结合

1． 将 CM-5 传感芯片模块嵌入 BIAcore 仪器。

2． 全部采用过滤并除气的 HEPES 缓冲盐溶液。

3． 将分别含有 NHS 、 EDC 、乙醇胺和 RAM Fc 以及 20 mmol/L HCl 各 100 μ l 的小管置于 BIAcore 自动进样器架的适当位置。

4． 将一个空管置于 BIAcore 自动进样器架上。

5． 开动仪器，以 5 μ l/min 的流速流过一个流动池。

6． 将 75 μ l 的 NHS 加入到一个空管中。

7． 在同一个管中再加入 75 μ l 的 EDC 。

8． 将含有 NHS 和 EDC 的小管中的成分混匀。

9． 注射 35 μ l NHS/EDC 混合物使表面活化。

10．  注射 35 μ lRAM Fc 到活化表面与抗体结合。

11．  注射 35 μ l 乙醇胺使过量的反应基团失活。

12．  快速注射 10 μ l 的 20 mmol/L HCL ，然后用 Extraclean 除去非共价结合型材料。

13．  通过在开始注射 RAMc 前放置一个基线报道点，并在注射 20 mmol/L HCl 结束后 2 min 放置第二个报道点，来测定结合 RAMc 水平。

14．  关闭流动液，关闭命令窗口，保存报道文件。

 

 

检测抗 -TSH 与 RAMc 表面的结合

15．  开动仪器，使含有结合 RAMc 的流动池流速为 10 μ l/min 。

16．  注射 10 μ l 的 2 μ g/ml 抗 -TSH 。

17．  快速注射 10 μ l 的 20mmol/L HCl ，然后用 Extraclean 再生 RAMc 表面。

18．  为了测定结合到 RAMc 表面的重现性，用可以与抗 TSH 结合引起 250 Rus 所需的体积重复注射抗 TSH 。

19．  快速注射 10 μ l 的 20 mmol/L HCl ，然后用 Extraclean 再生 RAMc 表面。

20．  关闭流动液体，关闭命令窗口，保存报道文件。

 

 

检测 TSH 与捕获抗 -TSH 表面的结合

21．  开动仪器，使含有结合 RAMc 的流动池的流速为 10 μ l/min 。

22．  注射 10 μ l 的 2 μ g/ml 抗 -TSH 。

23．  注射 25 μ l 的 200 nmol/L TSH ，限定 120 s 的解离时间。

24．  快速注射 10 μ l 的 20 mmol/L HCl ，然后用 Extraclean 再生 RAMc 表面。

25．  关闭流动流，关闭命令窗口，保存报道文件。