蛋白质间相互作用研究方法：免疫共沉淀

相互作用在生理上的证实和探索

 

l      通过免疫共沉淀确定结合蛋白

 

1． 用磷酸盐缓冲液洗 30 块 10 cm 培养板上的适宜细胞。刮去每块板上的细胞到 1 ml 冰冷的 EBC 裂解缓冲液中。

2． 将每毫升细胞悬液转移到微量离心管中，在微量离心机上 4 ℃以最大速度离心 15 min 。

3． 收集上清（约 30 ml ）并加入 30 μ g 的适当抗体， 4 ℃摇动免疫沉淀物 1 h 。

4． 加入 0.9 ml 的蛋白质 A-Sepharose 悬液， 4 ℃摇动免疫沉淀物 30 min 。

5． 用含 900 mmol/L NaCl 的 NETN 洗蛋白 A-Sepharose 混合物，再重复洗 5 次。最后，用 NETN 洗一次。

6． 吸出混合物的液体部分。加入 800 μ l 的 1 × SDS 胶加样缓冲液到球珠中，煮沸 4 min 。

7． 将样品加入到大孔的不连续 SDS-PAGE 梯度胶中，在 10 mA 的恒定电流下电泳过夜。

8． 通过考马斯蓝染色观察蛋白质泳带。

9． 从胶上切下目标带，将其放到微量离心管中，用 1ml 50% 乙腈洗两次，每次 3 min 。

10．  用胰蛋白酶消化胶中的蛋白质，再将肽电洗脱。

11．  通过窄孔高效液相色谱分离肽。将收集的肽在 ABI 477A 或 494A 机器上进行自动 Edman 降解测序。