逆转录、qPCR 实验还出错？这几点你可能没注意！

RT-PCR 和 qPCR 是大多数实验汪在科研道路上需要做的实验，大家看到这儿一定不以为意，这不就是两个简单的小实验，看两次 protocol，后面都不需要操作指南也能记住步骤的。可是…记住了实验步骤就真的等于能做好实验？能得到想要的数据、漂亮的曲线吗？

看似简单的实验，实则暗流汹涌，稍不注意的地方就可能有旋涡把实验前进的小船打翻，要不怎么会有那么多人为此悲催的实验结果整日愁眉苦脸，屡战屡败，屡败屡战……最后还是得战战战！

其实，多注意点小细节就可能帮助实验汪们减轻这样的苦恼，少做一些不必要的重复劳动，从而一战成功（即使不是一战，也少了 n 战）。

RT-PCR 虽然只是逆转 RNA，但却是决定后续 qPCR 或其他实验成功的关键因素，是重中之重。以下几点 tips 请查收：

1. 提取好的 RNA，先检测质量

对 RNA 质量的检测包含 RNA 完整度测定及 RNA 产量测定两部分：

（1）RNA 的完整度对 cDNA 的合成结果会产生重要的影响。

通过琼脂糖凝胶电泳进行检测是方法之一，这也是一般实验室最常用的方法。通常完整的真核 RNA 应包括 28S、18S 及 5S RNA 条带，且 28S 条带的强度应是 18S 条带的两倍左右（两个条带强度大致相同也是可以的）；另一种方法是使用仪器进行检测（Agilent BioAnalzyer），通过 RIN 值的高低反应 RNA 不同的完整度，当 RIN 为 8 - 10 时，表示 RNA 质量非常好；当 RIN 值低于 7 时，则说明 RNA 有降解，可能会导致基因表达测定不准确等问题，但这种方法成本较高，主要是应用在建库实验中，一般实验室里并没有这种仪器。

（2）同时对 RNA 产量的准确评估也很重要，保证后续实验的进行。

小编以前做实验的时候一般是选用 Nanodrop 仪器进行检测，该仪器使用非常方便，不需要对样品进行稀释，并且具有非常宽的 RNA 测量范围。还有一些同学会使用传统紫外分光光度法或者梯度点样用琼脂糖凝胶电泳进行粗略检测，但这两种方法不仅准确度较低，而且紫外分光光度法对样本的消耗也较大，并不是很推荐哦。

2. 去除基因组 DNA 的污染很重要

RNA 中存在的基因组 DNA（gDNA）污染可能是最终 PCR 反应中假阳性结果出现的原因。一方面我们可以通过设计跨内含子的引物去除 gDNA 的影响，但这种引物设计耗时耗力，并且对于没有内含子的基因，这种方法可能就行不通了。 这时，通过 DNase 对提取的 RNA 进行预处理成为简单并且唯一的方法。诺唯赞的三代逆转录酶系列产品（R312/R323）含有 gDNA 清除模块，2 min 就能有效的清除基因组 DNA 的污染。

3. 选取合适的 RT Primer 是关键

通常 RT primer 可分为三类：oligo dT，随机引物以及基因特异性引物。根据不同的实验需求需要选择适合的引物进行使用。oligo dT 可以获得真核生物 mRNA 全长；当 RNA 没有 polyA 尾（原核 mRNA 或 rRNA）或断裂时，就需要考虑使用随机引物进行 RNA 的反转录，随机引物可以很均一的逆转出 RNA 上的信息，但逆转出的 cDNAs 长度都较短。此时，对于扩增真核生物的 total RNA 来说，这时随机引物和 Oligo-dT 引物的混合物能给出一个令人满意的结果。

诺唯赞的 HiScript^® III 1st Strand cDNA Synthesis Kit (+gDNA wiper)（R312）或可助大家一臂之力，里面包含单独成管的 Oligo (dT)20VN 及 Random hexamers，可以根据模板类型和后续实验需求灵活选择或按比例混和；还有 HiScript^® III RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)（R323），包含逆转录反应所需的所有组分，当然 Random primers 和 Oligo (dT)20VN 的混合引物也直接在这管 SuperMix 中，只需加入模板 RNA，20 min 内即可完成逆转录反应，极为方便！

第三个选择就是基因特异性引物，用此类引物仅合成所需要的 cDNA，适用于目的序列已知的情况。

4. 克服 RNA 复杂的二级结构可不简单

如果要获取全长 cDNA，那么 RNA 二级结构的问题就无可避免，一般的逆转录酶在遇到此类结构后，容易停止反应或从模板上脱落下来。要想判断模板 RNA 是否具有二级结构还比较困难，此时需要 65℃，5 min 对其进行充分变性，打开复杂结构以避免其对实验结果的影响。选用一款好酶也可以让实验事半功倍，诺唯赞的三代逆转录酶系列产品，酶的性能得到了大幅度的提升，在常规温度下对于含有高级结构的模板，扩增效率表现的也十分优异！

以上这些注意一下可能就会对我们的 RT-PCR 实验大有帮助哦！俗话说，万事开头难，解决了逆转录这个难题，后续的其它实验就等于是成功了一大半。一般大家后续都会接着做 qPCR 实验，其实它和 PCR 差不多，只是 qPCR 过程中每个循环都有数据的实时记录，因此可以对起始模板数量进行精确的分析。实验操作其实没有什么特别难的，一些实验中的注意事项大家也都是耳朵要听出老茧了。这里小编再为大家总结容易忽视的 3 小点：

• 准确加样别混乱

很多同学前期好不容易成功做完了逆转录，这时候可能有些疲累了。筛引物、做定量的时候要加样的孔也较多，即使使用了 qPCR 预混液，也有加错样的可能发生。诺唯赞的 ChamQTM SYBR^® Color qPCR Master Mix 系列（Q411 /Q421 /Q431 /Q441）提供不同颜色的试剂，利用移液过程中的变色效应，追踪移液过程，可以极大的减少移液错误。

• 引物设计有原则

在使用 SYBR 染料法时，引物设计需遵循以下原则：引物长度 18～25bp，产物长度 80～300bp，GC 含量 40～60%，避免引物内含有互补序列，3』端尽量不要出现含有连续三个以上的 G 或 C 的片段，真核基因设计引物时最好跨内含子哦。

• 选择合适 ROX 参照染料

各位同学在选购产品、做实验时，首先要弄清自己实验室的仪器对应哪种 ROX（High 还是 Low）！试剂买回来，样也加好了，最后发现不能用在自家仪器上，内心也一定是很崩溃。诺唯赞的染料法荧光定量专用预混液提供各种 ROX 供选择，如果不想这么麻烦，ChamQTM Universal SYBR^® qPCR Master Mix （Q711）那是极好用的，里面特殊的 ROX 参比染料，适用于所有 qPCR 仪，无需在不同的仪器上调整 ROX 浓度！