Chip 实验最后的 PCR 需要注意什么问题？

昨天做了荧光定量pcr，试着测了一下浓度，2.8和5.6，不知道为什么这么低。可能与长度被打碎了有关？

http://www.biomart.cn/infosupply/19550132.htm

1. Chip 实验最后免疫沉淀后得到的模板用酚：氯仿或者PCR纯化试剂盒提取都行的，但浓度一般都不会太高，通常在十几到几十ng/uL之间，因为浓度太低，所以纯度（吸光值260:280）也不能准确地测取。最重要的是阳性对照要能在PCR后检查到明显的条带。2. PCR引物设计一般退火温度要相近，分别位于基因组上靶序列上下游各50~150bp左右，最好使靶序列位于PCR产物链的中间位置。正如上面这位同仁所说，PCR产物不能太大（<250bp）。最重要的就是要先用genome DNA和Input验证过，这对引物在PCR体系是能够扩出条带的。另外就是因为Chip得到的产物会比较少，所以一般PCR的循环数要有保证，一般都在30个循环以上（35~45，根据具体结合能力而定）。

1. ChIP中用于PCR的DNA我们使用Qiagen的试剂盒纯化，溶解在TE里，没有测浓度和纯度，不过试剂盒抽提的一般质量都是很好的。2. 关于PCR，要注意的是，扩增片段不能太长，一般应小于200bp，因为基因组经超声处理后会断裂成比较小的片段（200到500bp）。