手把手教你做细胞转染

今天霸霸带大家学习细胞转染的两种方法：脂质体法与磷酸钙沉淀法。

实验原理

外源基因进入细胞主要有四种方法：电击法、磷酸钙法和脂质体介导法和病毒介导法。这里以脂质体介导法为例说明。

脂质体法是利用不同的载体物质携带质粒通过直接穿膜或者膜融合的方法使得外源基因进入细胞。利用脂质体转染法最重要的就是防止其毒性，因此脂质体与质粒的比例，细胞密度以及转染的时间长短和培养基中血清的含量都是影响转染效率的重要问题，通过实验摸索的合适转染条件对于效率的提高有巨大的作用。

脂质体法实验操作

☞ 材料准备

1. 试剂：293T 细胞、MyoD 表达质粒和 EGFP 表达质粒、DMEM 培养基、链霉素/青霉素（双抗）、FCS（小牛血清）、PBS（磷酸盐缓冲溶液）、胰酶/EDTA 消化液、转染试剂（TransFast）

2. 仪器与耗材：微量移液器和 Tip 头、酒精灯、血球计数板、涡旋振荡器、恒温水浴箱、离心机、35 mm 培养皿、转染管、15 ml 离心管、观察用倒置显微镜、荧光显微镜和 CCD

☞ 实验操作

1. 细胞传代后用培养液重悬细胞，细胞计数后选择 0.8X10⁶ 个细胞加入一个 35 mm 培养皿。将合适体积完全培养液加入离心管中，混匀细胞后轻轻加入培养皿中，使其均匀分布。将培养皿转入 CO2 培养箱中培养，第二天转染。

2. 细胞转染

（1）转染试剂的准备

将 400 ul 去核酸酶水加入管中，震荡 10 秒钟，溶解脂状物。震荡后将试剂放在- 20 ℃ 保存，使用前还需震荡。

（2）选择合适的混合比例（1：1-1：2/脂质体体积：DNA 质量）来转染细胞。在一个转染管中加入合适体积的无血清培养基。加入合适质量的 MyoD 或者 EGFP 的 DNA，震荡后在加入合适体积的转染试剂，再次震荡。

（3）将混合液在室温放置 10～15 分钟。

（4）吸去培养板中的培养基，用 PBS 或者无血清培养基清洗一次。

（5）加入混合液，将细胞放回培养箱中培养一个小时。

（6）到时后，根据细胞种类决定是否移除混合液，之后加入完全培养基继续培养 24～48 小时。

3. 第二次细胞传代

（1）在转染后 24 小时，观察实验结果并记录绿色荧光蛋白表达情况。

（2）再次进行细胞传代，按照免疫染色合适的密度 0.8X10⁵ 个细胞/35 mm 培养皿将细胞重新装入培养皿中。

（3）在正常条件下培养 24 小时后按照染色要求条件固定。

转染条件优化可以参考 TransFast 的使用说明书。

看了以上的实验方法，霸霸相信实验步骤方面你一定没问题了，接下来实验能否做出结果实验耗材就起着关键的作用，你的实验耗材都挑好了吗？