手把手教你染色体步移
丁香园
染色体步移是一种常用的克隆已知基因旁侧序列的技术。基因的表达调控已成为分子生物学研究热点之一，启动子是基因表达调控的重要顺式元件，启动子的克隆对于研究基因表达调控，构建基因工程载体，表达目的蛋白有着重要的意义。
启动子克隆的方法很多，常见的扩增启动子或已知序列末端旁侧的核苷酸序列的方法有两种：
方法一 酶切加接头
1 大量提取基因组 DNA
（1）取样品 100 mg，置于 1.5 mL EP 管中，加入 500 uL 裂解液（56 °C），用研磨棒充分匀浆。
（2）加入 350 uL 苯酚（pH=8.0）和 300 uL 氯仿，颠倒混匀，静置 5 min，14 000×g 离心 10 min。
（3）取上清至新 Ep 管中，加入 270 ul 苯酚和 270 ul 氯仿混匀，静置 5 min，14 000×g 离心 10 min。
（4）取上清至 EP 管中，加入 270 ul 苯酚和 350 ul 氯仿，轻混，静置 5 min，14 000×g 离心 10 min。
（5）取上清至新的 EP 管，加入 500 ul 苯酚，静置 5 min，14 000×g 离心 10 min。
（6）去上清液（约 400 uL）至新管，加入 50 ul 7.5 M 的 NH4Ac 和 800 ul 冰乙醇（-20 °C）存放，置于冰上 15 min，使 DNA 充分沉淀，14 000×g 离心 5 min。
（7）弃尽上清，置于室温晾干，加入 50～100 ul 无菌水，待 DNA 全部溶解后，加入 1 ul RNase（20 ug/ul），37 °C 孵育 1 小时，于 -20 °C 保存。
（8）取 5 ul 的 gDNA 进行 1.5% 琼脂糖凝胶电泳，以鉴定其完整性，并在分光光度计测其浓度，A260/280 的数值应在 1.8～2.0 之间，并将其浓度调整至 100 ng/ul，-20 °C 保存。
2 Genome-walking 文库建立
（1）取 4 个 1.5 mL EP 管，做好标记（Dra I、Stu I、Pru II 和 EcoR V），分别依次加入：
（2）轻弹混匀，勿涡旋，以免 DNA 断裂。37 °C 孵育 2 h。轻弹混匀，重新置于 37 °C 过夜（16～18 h）。
（3）从每个反应管中分别取 5 ul 酶切产物，进行 1.5% 琼脂糖凝胶电泳，并取 5 ul 的纯化基因组作为对照。
3 酶切基因组 DNA 的纯化
（1）将上述酶切产物中加入等体积的苯酚：氯仿：异戊醇（体积比 25: 24: 1），混匀后 12 000 rpm 离心 10 min，取上清。
（2）加入等体积氯仿：异戊醇（体积比 24: 1），混匀，12 000 rpm 离心 10 min，取上清。
（3）加入 1/10 体积的 3 mol/L NaAc（pH 5.2）、2 倍体积预冷的无水乙醇，12 000 rpm 离心 10 min，沉淀用 70% 乙醇漂洗 2 次后，风干。
（4）用适量的 1×TE 溶解后于 –20 ℃ 储存。
4 连接
人工合成接头引物：
AdaporA 5'-GTAATACGACTCACTATAGGGCACGCGTGGTCGACGGCCCGGGCTGGT -3'
AdaptorB 5'-PO4- ACCAGCCC-H2N-3'
合成接头：
两个接头的浓度均为 50 µmol/L。
将 AdaporA 和 AdaporB 各取 10 µL 混合均匀，80 ℃ 变性 10 min，室温冷却 1 h，制作成接头，-20 ℃ 保存备用。
分别将经不同内切酶消化的 DNA 和合成的接头在 16 ℃ 条件下连接过夜。连接体系为：
70 ℃ 保温 5 min 结束连接反应。加入 72 μL TE 缓冲液（pH 8.0）稀释连接产物，并作为模板进行扩增。
5 PCR 反应体系和扩增程序
GSP 设计要点：
引物长度：26～30 bp（如果引物的 Tm 值很高，引物的长度也不要少于 26 bp，推荐使用 27bp）
GC 含量：40～60%
引物不能向后折叠形成发卡结构，3' 末端序列的引物不能与接头引物 3' 末端形成氢键
3' 末端不能有连续超过 3 个 G 或 C
将用于 5' 端延伸的基因特异性引物以及 3' 端延伸的基因特异性引物分别与接头引物 AP1（5'-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3'）和巢式接头引物 AP2（5'-ACTATAGGGCACGCGTGGT-3'）组合进行 nested PCR 扩增。
采用 25 μL 扩增体系：10×LA buffer 2.5 μL，dNTP Mixture（2.5 mmol/L）2.0 μL，接头（adaptor primer）（10 μmol/L）2.0 μL，基因特异引物（10 μmol/L）2.0 μL，接头 - DNA 连接产物（adaptor DNA）1.5 μL，LATaq DNA 聚合酶（5 U/μL）1.5 U，dd H2O 补足 25 μL。将首轮扩增产物以 TE 缓冲液（pH 8.0）稀释 10 倍作为 Nested PCR 的模板。
扩增程序：94 ℃ 25 s，72 ℃ 4 min，7 个循环；94 ℃ 25 s，67 ℃ 4 min，32 个循环；67 ℃ 7 min，4 ℃ 保存。
方法二 TAIL-PCR 技术
1 基因组 DNA 提取（同上）
2 TAIL-PCR 引物设计
根据已知的基因组 DNA 片段序列，以待扩增的 5' 末端或 3' 末端方向设计 3 条嵌套的特异性引物，引物 SP2 设计位置在 SP1 内侧，SP3 位于 SP2 内侧，这 3 条引物分别为第 1 至第 3 轮反应的下游引物。引物 FP1 到 FP4 为上游简并引物，用于第 1 轮扩增的 4 个平行反应；FSP1 和 FSP2 分别作为第 2 和第 3 轮扩增反应的上游引物或下游引物（表 1）。SP1-3 设计的要点同上。
表 1 用于 TAIL-PCR 扩增的引物
3 TAIL-PCR 扩增
（1）TAIL-PCR 反应体系
Pre-amplification（20 ul）：10×Ex Taq Buffer（Mg2+ Plus）2.0 ul， dNTP Mix（各 2.5 mM）2 ul，任 1 种 SP1 引物（20 uM）1 ul，引物 FP1-4（10 uM）1 ul，DNA 模板 1 ul，Ex Taq 酶（5 U/ul）0.2 ul，dd H2O 补足至 20 ul。
Primary TAIL-PCR（25 ul）：10×Ex Taq Buffer（Mg2+ Plus）2.5 ul， dNTP Mix（各 2.5 mM）2 ul，引物 SP2（10 uM）1 ul，引物 FSP1（10 uM）1 ul，DNA 模板（预扩增产物稀释 50 倍）1 ul，Ex Taq 酶（5 U/ul）0.25 ul，dd H2O 补足至 25 ul。
Secondary TAIL-PCR（25 ul）：10×Ex Taq Buffer（Mg2+ Plus）2.5 ul， dNTP Mix（各 2.5 mM）2 ul，引物 SP3（10 uM）1 ul，引物 FSP2（10 uM）1 ul，DNA 模板（上一轮扩增产物稀释 10 倍）1 ul，Ex Taq 酶（5 U/ul）0.25 ul，dd H2O 补足至 25 ul。
（2）TAIL-PCR 反应程序（表 2）
表 2 TAIL-PCR 反应程序
Table 2 Thermal conditions for TAIL-PCR
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