为什么你的 qPCR 重复性差？灵敏度低？扩增易受抑制？那是你还不知道数字 PCR

相信做 qPCR 的研友经常会碰到以下令人抓狂的时刻：

• 三个重复的 Cqmax 和 Cqmin 能差到两个循环；

• 提的样本中总是含有很多 PCR 抑制剂，导致 Cq 值偏大；

• 极低丰度样本的 Cq 值总是游走在 40 和 N/A 边缘，让人崩溃；

• 绝对定量时需要的标准品既没有商品化，自己制备起来又很费时费力……

数不胜数的坑，等着有人来跳……

那真的束手无策了吗？

其实归结起来，qPCR 实验中碰到的难题无非是重复性差、扩增易受抑制、灵敏度低和需要标准曲线等，接下来介绍的 Digital PCR（数字 PCR）就可以完美的解决这些问题！

数字 PCR 是什么？

数字 PCR 是一种新型的核酸（DNA、cDNA 或 RNA）定量技术，它采用有限稀释的方法，使用泊松分布分析数据从而得到靶标的绝对拷贝数浓度。

数字 PCR 实验中，一个完整的 qPCR 反应体系（包括模板、DNA 聚合酶、引物、探针等）被分隔为若干个（通常数万个到几百万个）独立的反应区间（纳升级体积），经过 PCR 扩增后，包裹有靶标 DNA 的反应区间会发出荧光信号，标记为阳性；反之为阴性。

最后根据阴性反应区间的比例经过泊松分布计算得到靶标 DNA 的拷贝数浓度。

图片来源：Analytical chemistry

其实数字 PCR 不算是新技术了，它的原型可以追溯到 1992 年。Sykes 等报道了基于样品有限稀释和泊松分布数据处理的巢式 PCR 定量技术，并提出了数字 PCR 的构想 [1]。

1999 年，Vogelstein 和 Kinzler 采用 96 孔板系统发展了微升级的 PCR 扩增方法，用于结肠癌的突变基因 ras 的定量分析 [2]，使数字 PCR 的应用实践成为了可能。

后来芯片蚀刻技术和微流控技术的发展，使得数字 PCR 真正有了用武之地。

图片来源：文章截图

数字 PCR 的优势

相较于 qPCR，数字 PCR 有以下优势：

1. 真正的绝对定量，无需标准品和标准曲线；

2. 不再像 qPCR 那样严重依赖于扩增效率，对 PCR 抑制耐受程度高，模板适用度广；

3. 更高的分辨率，能够区分 1.1 倍的浓度差异，适合高拷贝数的 CNV（16 copy vs 18 copy）实验；

4. 更高的灵敏度，可以检测到单拷贝的靶标，适合单细胞基因表达等研究。

5. 重复性好，intra-assay 和 inter-assay 的 CV 较 qPCR 低 [3]。

数字 PCR 实验的操作

数字 PCR 的实验无需太过复杂的操作，但需要相关设备的辅助才可以实现。数字 PCR 从 partition 制备方式上分为芯片式和微滴式，操作大同小异，一般分为以下几步：

1. 配置 Reaction Mix。包含引物、荧光探针或者染料、模板和 DNA 聚合酶，不同厂家对体积要求也不一，一般 15 - 25 μl。

2. Partition 分隔。通过芯片或者微流控设备将配好的体系处理成 10000 - 30000 个 partition，不同的厂家其 partition 的数量也不同。

3. PCR 扩增。使用普通的 PCR 循环仪或者平板扩增系统将生成的 partition 进行扩增。

4. 读取数据。使用 CCD 拍照方式或者流式细胞术技术对 partition 进行信号读取，最后软件根据阴性的 partition 比例计算得到靶标的浓度，单位是 copy/μl。

数字 PCR 的应用

目前数字 PCR 的应用已经非常成熟，通俗的讲，qPCR 能做的，数字 PCR 轻松加愉快，qPCR 做不到的，数字 PCR 也可以胜任。

SNP 方面，与疾病的分子标志物检测相关的文献多如过江之鲫，尤其是非小细胞肺癌相关的 EGFR 突变。Oxnard 等使用数字 PCR 技术监测血浆中 EGFR 敏感突变和耐药性突变（T790M）[4]。

基因表达方面，已经深入到单细胞的水平。Albayrak 等使用数字 PCR 研究单细胞基因的转录组丰度和蛋白组丰度的相关性 [5]，其中用到的邻位连接技术 PLA 很有新意，将低丰度蛋白的检测转化为相对容易的 DNA 检测。

CNV 方面，数字 PCR 可以用于检测皮肤中体细胞的拷贝数嵌合现象 [6]。

当然也有其他方向的各种新奇应用，比如四种不同 RNA 剪接体的同时检测 [7]，将 T4 单细胞包进 partition 中进行 HIV 病毒库的检测 [8] 等。

套用句过时了的话：只有你想不到的，没有数字做不到的。

如果小伙伴们对数字 PCR 感兴趣的话，接下来的几期，笔者会 focus 在数字 PCR 的实验设计方面，希望能够帮助大家加深对这一技术的理解。

参考文献：

1.Sykes, P. J., et al. "Quantitation of targets for PCR by use of limiting dilution." Biotechniques 13.3 (1992): 444 - 449.

2.Vogelstein, Bert, and Kenneth W. Kinzler. "Digital pcr." Proceedings of the National Academy of Sciences 96.16 (1999): 9236 - 9241.

3.Bharuthram, Avani, et al. "Comparison of a quantitative Real-Time PCR assay and droplet digital PCR for copy number analysis of the CCL4L genes." Infection, Genetics and Evolution 25 (2014): 28 - 35.

4.Oxnard, Geoffrey R., et al. "Association between plasma genotyping and outcomes of treatment with osimertinib (AZD9291) in advanced non–small-cell lung cancer." Journal of clinical oncology 34.28 (2016): 3375.

5.Albayrak, Cem, et al. "Digital quantification of proteins and mRNA in single mammalian cells." Molecular cell 61.6 (2016): 914 - 924.

6.Abyzov, Alexej, et al. "Somatic copy number mosaicism in human skin revealed by induced pluripotent stem cells." Nature 492.7429 (2012): 438.

7.Sun, Bing, and Yun-Ling Zheng. "Simultaneous quantification of multiple alternatively spliced mRNA transcripts using droplet digital PCR." Digital PCR. Humana Press, New York, NY, 2018. 387 - 400.

8.Yucha, Robert W., et al. "High-throughput characterization of HIV- 1 reservoir reactivation using a single-cell-in-droplet PCR assay." EBioMedicine 20 (2017): 217 - 229.