这些抗体制备问题是你最关心的吗？

抗体制备是免疫学研究的基础。制备一个合适的抗体将会决定着免疫实验的成败。抗体制备过程涉及到很多个方面，比如免疫原如何设计、免疫过程的优化、目的抗体筛选、抗体纯化、应用鉴定等。日前，义翘神州杨嘉慧博士曾就「抗体制备关键技术平台和难点解析」进行深入讲解，接下来我们将会对一些关键的技术难点进行解答。

1. 免疫原是如何设计的？有什么原则？

解答：免疫原可以是天然蛋白也可以是重组蛋白，甚至是多肽、DNA，所以免疫原的设计主要从两个方面考虑：免疫原分子的特点抗体应用。结合免疫原分子的特点，抗体的应用可以提供预计识别的表位类型，确定使用哪种类型的免疫原和免疫原的序列。

2. DNA 免疫的原理和方法是什么？

解答：将含有编码某种抗原基因序列的质粒载体作为免疫原，直接导入动物细胞内进行表达，诱导宿主细胞对该抗原蛋白产生免疫应答，产生针对目的蛋白的抗体，再通过杂交瘤融合或基因文库筛选获得单克隆抗体，或通过血清纯化获得多克隆抗体。

DNA 免疫方法，目前主要有 3 种：肌肉注射加电转、静脉高压注射法和基因枪肌肉注射。

3. 对于同一种抗原，人源的噬菌体库筛出的抗体和人体分离的抗体有什么区别？

解答：应该说各有优势。人源的噬菌体库筛选出的抗体，在一些情况下，可能会产生一些非天然存在的抗体，重链和轻链的配比不一定是天然的。从人体 B 细胞获得的抗体，是直接分离和测序筛选的，抗体的重轻链处于天然状态。当然，我们也不能说噬菌题库筛选的抗体就不好，因为一般更多的是评价它的亲和力和免疫应用，以及后续的生产表达及结构等，需要综合评价。

4. 噬菌体展示淘洗固相筛选和液相筛选效果有差异吗？

解答：结合义翘神州多年的抗体筛选经验，一般会首选固相淘选，因为这种方法比较简单，不需要使用生物素标记。如果这种筛选方法没有筛选到我们感兴趣的抗体的话，我们也会过渡到液相筛选的方法。

5. 噬菌体淘洗怎么保证库的多样性？筛选上有什么注意的原则？

解答：淘洗过程中很多因素都会影响多样性的结果，比如方法的选择、固相、液相等。其次 pH 值是淘洗中一个重要参数。还有就是淘洗的力度和洗脱的时间也对多样性结果有很重要的影响。需要多个方面进行试验条件的优化。

6. 应用于 IHC 的单抗开发，在抗原设计上，有什么侧重点？

解答：因为 IHC 的实验过程涉及到了对它本身抗原的一个变性的过程，或者说是天然细胞里面靶点的变性过程。所以在设计的时候，我们会倾向于设计成一个线性的表位，所以一般来说我们倾向于使用多肽这种免疫原的方式，来进行免疫组化抗体的开发。

7. 噬菌体展示与杂交瘤制备抗体比较，哪种更好？

解答：这个可能更多是考虑噬菌体展示和杂交瘤的优缺点。首先从周期上来说的话，相对来说，噬菌体的方式时间更短一些，另外从筛选上来说的话，噬菌体展示的方法比较稳定，而且比较简单一些，操作上具有优势。但是杂交瘤的方法，毕竟是从一种类似于细胞内部产生抗体的方式，所以在某些方面的话，它产生的抗体更多的是天然的重链与轻链的配比，这一点，在噬菌体上不能做到百分之百。

8. 人源化抗体的制备噬菌体展示和转基因小鼠平台的优势比较？

解答：噬菌体展示技术具有周期短、准确、不受氨基酸位点限制等特点，能够通过多种淘洗和检测方式对不同表位进行筛选，生产成本相对低廉。不足之处在于受到库容、表达偏好性和展示效率的影响，抗体多样性会存在一定程度的限制，同时通过表面重塑等方法对提高人源化抗体亲和力的成功率并不稳定。

转基因小鼠制备的全人源抗体，不仅大大减少了潜在的免疫原性，而且由于抗体是在体内产生，经历了正常的装配和成熟过程，从而保证抗体具有较高的靶亲和力。大部分转基因小鼠获得的单克隆抗体亲合力在 0.1-10nM 之间，也有些转基因小鼠单抗能达到皮摩尔级或者次皮摩尔级。但其不足之处在于前期研发投入的周期长，成本高。而且也由于抗体是在小鼠体内装配，因而产生的单抗具有鼠糖基化模式，使得这些单抗最终不是全人源化模式。

9. 抗体如何进行长期保存，并保持效价的稳定？

解答：一般情况下，抗体属于比较稳定的蛋白。所以多数情况下，厂家会推荐-20℃～-80℃ 长期保存即可，为了避免反复冻融尽量分装后保存。此外，也可以通过加甘油避免反复冻融。当抗体浓度低时加 BSA 减少抗体吸附起稳定剂的作用。对于一些少数抗体，需要通过优化筛选缓冲液已达到保持抗体稳定的效果，优化包括盐浓度、pH、缓冲体系等。