［连载］原核表达研究者关心的10个问题（3）
丁香园论坛
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原核表达研究者关心的10个问题 (3)
pET 是目前应用最为广泛的原核表达系统，已经成功地在大肠杆菌中表达了各种各样的异源蛋白。经pET系统过与使用过和正在使用这个系统的科学家的交流，我们发现了一些在使用pET系统的过程中以及原核表达中的一些常见问题。在此，我们选取了其中一些比较有代表性的问题，附上我们的建议改进方案，并期待和你一起分享成功的喜悦。
7. 如果IPTG诱导后细胞停止了生长，是不是表示细胞死了？
T7 RNA聚合酶非常活跃，T7转录和翻译信号极强，因此，一旦诱导，细胞的主要生理活动都向着目的蛋白表达的方面转化。在通常情况下，细胞将停止生长，形成克隆的能力大大降低，但并未死亡。菌落形成试验可以用来检测表达系统的性能。也有一些例外情况，例如特别的目的基因以及一些极为严紧的载体/宿主菌组合 （比如含有pLysE的宿主菌）等，这时在诱导后菌落还是会继续生长。
8. E. coli会去除成熟蛋白N-端的甲硫氨酸吗？这种加工对目的蛋白的稳定性有何影响？
N-端fMet是否被去除受倒数第二个氨基酸影响。这个加工过程由甲硫氨酸氨基肽酶催化，并受以下关系支配：去除的困难程度随倒数第二位氨基酸的支链大小的增加而降低(Hirel et al (1989)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 8247-8251; Lathrop, B.K. et al. (1992) Prot. Exp. Purif.3, 512-517)。上述研究者在实验中发现以下氨基酸种类出现在倒数第二的位置上时，此加工过程极少发生或根本没有发生：His, Gln, Glu, Phe, Met, Lys, Tyr, Trp, Arg。而当倒数第二位上是其它种类的氨基酸时，加工过程发生的可能从16%到97%，Tobias等人(Science 254, 1374-1377,1991) 确定了在大肠杆菌中蛋白氨基末端氨基酸与其稳定性之间的关系，也即“N-端原则”。具他们报导：如果下列氨基酸位于氨基端时蛋白的半衰期仅为2分钟：Arg, Lys, Phe, Leu, Trp和Tyr。相反，其它氨基酸位于氨基端时可以使受检蛋白的半衰期长达10小时以上。综上两条研究可以得出结论：Leu在氨基末端时很容易因为fMet被去除而暴露出来，从而导致蛋白的迅速水解。显然，当采用pET载体上的 Nco I 或 Nde I位点表达非融合蛋白时，完全不必担心Leu的密码子出现在倒数第二的位置上。
9. 除了毒性和降解，还有些什么因素会影响目的蛋白的表达水平？
a.) mRNA转录子中的二级结构会干扰AUG翻译起始密码子和/或核糖体结合位点(Tessier et al. (1984) Nucl.Acids Res. 12, 7663-7675; Looman et al.(1986) Nucl. Acids Res. 14, 5481-5496; Lee(1987) Gene 58, 77-86)。所有pET载体的转录产物都是下列两种之一：
rbs Nde I/Nco I
5'...AAGAAGGAGAUAUACAUAUG...3'
5'...AAGAAGGAGAUAUACCAUGG...3'
如果发现表达很差，你可以通过检查编码插入序列的链上的与上述序列互补的序列，
(5'-CATATGTATATCTCCTTCTT-3'或
5'-CCATGGTATATCTCCTTCTT-3')
以确定是否是因为存在潜在的二级结构造成麻烦。
b.) 目的基因中稀有密码子比较多也是常见的表达水平低的原因(Zhang et al. (1991)Gene 105, 61-72; Sorensen et al. (1989) J.Mol. Biol. 207, 365-377)。如果稀有密码子集中出现在氨基端情况更为严重(Chen and Inouye (1990) Nucl. Acids Res. 18, 1465-1473)。应该注意，跟据现有对大肠杆菌高表达的基因研究发现的有限的稀有密码子，已经观察到由于其对应的tRNAs水平很低，直接导致了翻译延伸的困难(Ikemura (1985) Mol. Biol. Evol. 2, 13-34)。
c.) 序列中的意外的终止密码子可能造成突变，这在PCR克隆产物的情况下较为突出。可以通过测序发现此类问题，也可以用体外翻译的方法确认重组子的表达能力，可以选用Novagen的Red Nova? 溶菌液进行测试。
10. 有时除了我的全长目的蛋白以外，还能看到截短的产物，这是怎么回事？
一个最直接原因就是蛋白水解了。然而第二点翻译起始也非常有可能(Preibisch et al. (1988) Gene 72, 179-186; Halling and Smith (1985) Bio/Technology 3, 715-720)。起始密码子AUG (Met) 的上游在RNA编码区有类似于核糖体结合位点序列(AAGGAGG)的间隔序列(通常是5–13个核苷酸)时，容易出现这种问题。截短蛋白在纯化全长蛋白的操作时往往造成麻烦。解决途径之一即是选用两端都带有融合标签的pET载体，例如pET-28和pET-30系列载体在N-端和C-端都有His?Tag?。这样，全长蛋白就可以通过提高咪唑浓度，在洗脱时将截短蛋白与全长蛋白区分开。pET-29和pET-30系列载体在N-端融合有S?Tag?序列而C-有His?Tag，因此可以先后用固定化S-蛋白和His?Bind? 树脂亲和纯化以获取全长蛋白(Kim and Raines(1994) Anal. Biochem 219, 165-166)。（完）
更多详细讨论，请参阅默克生化小组翻译编辑的第十版
《pET操作手册——原核表达宝典》。请向当地默克代理商索取。
pET 是目前应用最为广泛的原核表达系统，已经成功地在大肠杆菌中表达了各种各样的异源蛋白。经pET系统过与使用过和正在使用这个系统的科学家的交流，我们发现了一些在使用pET系统的过程中以及原核表达中的一些常见问题。在此，我们选取了其中一些比较有代表性的问题，附上我们的建议改进方案，并期待和你一起分享成功的喜悦。
7. 如果IPTG诱导后细胞停止了生长，是不是表示细胞死了？
T7 RNA聚合酶非常活跃，T7转录和翻译信号极强，因此，一旦诱导，细胞的主要生理活动都向着目的蛋白表达的方面转化。在通常情况下，细胞将停止生长，形成克隆的能力大大降低，但并未死亡。菌落形成试验可以用来检测表达系统的性能。也有一些例外情况，例如特别的目的基因以及一些极为严紧的载体/宿主菌组合 （比如含有pLysE的宿主菌）等，这时在诱导后菌落还是会继续生长。
8. E. coli会去除成熟蛋白N-端的甲硫氨酸吗？这种加工对目的蛋白的稳定性有何影响？
N-端fMet是否被去除受倒数第二个氨基酸影响。这个加工过程由甲硫氨酸氨基肽酶催化，并受以下关系支配：去除的困难程度随倒数第二位氨基酸的支链大小的增加而降低(Hirel et al (1989)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 8247-8251; Lathrop, B.K. et al. (1992) Prot. Exp. Purif.3, 512-517)。上述研究者在实验中发现以下氨基酸种类出现在倒数第二的位置上时，此加工过程极少发生或根本没有发生：His, Gln, Glu, Phe, Met, Lys, Tyr, Trp, Arg。而当倒数第二位上是其它种类的氨基酸时，加工过程发生的可能从16%到97%，Tobias等人(Science 254, 1374-1377,1991) 确定了在大肠杆菌中蛋白氨基末端氨基酸与其稳定性之间的关系，也即“N-端原则”。具他们报导：如果下列氨基酸位于氨基端时蛋白的半衰期仅为2分钟：Arg, Lys, Phe, Leu, Trp和Tyr。相反，其它氨基酸位于氨基端时可以使受检蛋白的半衰期长达10小时以上。综上两条研究可以得出结论：Leu在氨基末端时很容易因为fMet被去除而暴露出来，从而导致蛋白的迅速水解。显然，当采用pET载体上的 Nco I 或 Nde I位点表达非融合蛋白时，完全不必担心Leu的密码子出现在倒数第二的位置上。
9. 除了毒性和降解，还有些什么因素会影响目的蛋白的表达水平？
a.) mRNA转录子中的二级结构会干扰AUG翻译起始密码子和/或核糖体结合位点(Tessier et al. (1984) Nucl.Acids Res. 12, 7663-7675; Looman et al.(1986) Nucl. Acids Res. 14, 5481-5496; Lee(1987) Gene 58, 77-86)。所有pET载体的转录产物都是下列两种之一：
rbs Nde I/Nco I
5'...AAGAAGGAGAUAUACAUAUG...3'
5'...AAGAAGGAGAUAUACCAUGG...3'
如果发现表达很差，你可以通过检查编码插入序列的链上的与上述序列互补的序列，
(5'-CATATGTATATCTCCTTCTT-3'或
5'-CCATGGTATATCTCCTTCTT-3')
以确定是否是因为存在潜在的二级结构造成麻烦。
b.) 目的基因中稀有密码子比较多也是常见的表达水平低的原因(Zhang et al. (1991)Gene 105, 61-72; Sorensen et al. (1989) J.Mol. Biol. 207, 365-377)。如果稀有密码子集中出现在氨基端情况更为严重(Chen and Inouye (1990) Nucl. Acids Res. 18, 1465-1473)。应该注意，跟据现有对大肠杆菌高表达的基因研究发现的有限的稀有密码子，已经观察到由于其对应的tRNAs水平很低，直接导致了翻译延伸的困难(Ikemura (1985) Mol. Biol. Evol. 2, 13-34)。
c.) 序列中的意外的终止密码子可能造成突变，这在PCR克隆产物的情况下较为突出。可以通过测序发现此类问题，也可以用体外翻译的方法确认重组子的表达能力，可以选用Novagen的Red Nova? 溶菌液进行测试。
10. 有时除了我的全长目的蛋白以外，还能看到截短的产物，这是怎么回事？
一个最直接原因就是蛋白水解了。然而第二点翻译起始也非常有可能(Preibisch et al. (1988) Gene 72, 179-186; Halling and Smith (1985) Bio/Technology 3, 715-720)。起始密码子AUG (Met) 的上游在RNA编码区有类似于核糖体结合位点序列(AAGGAGG)的间隔序列(通常是5–13个核苷酸)时，容易出现这种问题。截短蛋白在纯化全长蛋白的操作时往往造成麻烦。解决途径之一即是选用两端都带有融合标签的pET载体，例如pET-28和pET-30系列载体在N-端和C-端都有His?Tag?。这样，全长蛋白就可以通过提高咪唑浓度，在洗脱时将截短蛋白与全长蛋白区分开。pET-29和pET-30系列载体在N-端融合有S?Tag?序列而C-有His?Tag，因此可以先后用固定化S-蛋白和His?Bind? 树脂亲和纯化以获取全长蛋白(Kim and Raines(1994) Anal. Biochem 219, 165-166)。（完）
更多详细讨论，请参阅默克生化小组翻译编辑的第十版
《pET操作手册——原核表达宝典》。请向当地默克代理商索取。
