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冻存和复苏

细胞治疗技术正扮演着越来越重要的角色。其中，CAR-T 细胞治疗、间充质干细胞（MSC）治疗以及 T 细胞治疗是三种备受关注的细胞治疗方法。这些治疗方法通过采集患者体内的特定细胞，经过体外激活、修饰、扩增等步骤，再将这些具有特定功能的细胞移植回患者体内，以达到治疗疾病的目的。为了更好地理解和应用这些治疗技术，下面我们将整合并详细叙述这三种细胞治疗的流程图内容，为研究人员和临床医生提供一个清晰的操作指南。CAR-T 细胞治疗流程间充质干细胞治疗流程 T 细胞治疗流程

CAR-T 细胞疗法自 2017 年首次获得 FDA 批准以来一直蓬勃发展，在血液恶性肿瘤治疗上表现优异，为 B 细胞急性淋巴细胞白血病等疾病的患者提供了完全治愈的可能性。但大部分实体瘤由于肿瘤微环境的影响，会阻碍 T 细胞浸润、活化和增殖，导致对 CAR-T 疗法反应有限。其主要的抑制机制包括 T 细胞受体信号传导的抑制以及炎性细胞因子的消耗，目前克服抑制性肿瘤微环境仍然是实体瘤免疫治疗的主要障碍。 2022 年 12 月 16 日，Science 发文表示，研究人员通过在 T 细胞上构建肿瘤特异合成性 Notch 受体（synNotch），可以在识别癌细胞后诱导产生 IL-2 促进 T 细胞活性，在胰腺肿瘤和黑色素瘤模型中可以有效增强 CAR-T 细胞或 TCR-T 细胞的肿瘤浸润，实验鼠体内的肿瘤清除能力以及其存活率均有显著提升，此类改良给 CAR / TCR-T 细胞在免疫抑制性实体瘤治疗领域带来新突破。 图：论文截图 目前 CAR-T 细胞治疗血液恶性肿瘤也仍面对四个主要挑战：肿瘤异质性以及目的抗原丢失免疫抑制性的肿瘤微环境CAR-T 细胞耗竭输注后的不良反应 面对这些挑战，

（1）促进免疫细胞的增殖和分化：生长因子能够通过调节细胞信号通路，促进免疫细胞的增殖和分化。白细胞介素-2（IL-2）：IL-2 是一种重要的免疫调节因子，能够促进 T 细胞和自然杀伤细胞（NK 细胞）的增殖和活化，增强其细胞毒性。粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）：GM-CSF 能够促进骨髓中粒细胞和巨噬细胞的发育和成熟，增强其吞噬和杀伤能力。（2）调节免疫细胞的表型和功能：生长因子可以通过调节免疫细胞的表型，影响其功能和免疫反应。转化生长因子-β（TGF-β）：TGF-β 是一种多功能细胞因子，能够抑制多种免疫细胞的增殖和分化，如 T 细胞、B 细胞和 NK 细胞。它在免疫抑制和免疫调节中发挥重要作用。干扰素（IFN）：干扰素具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节功能，能够激活免疫细胞，增强其抗病原体能力。（3）改善免疫微环境：生长因子可以通过调节免疫微环境，影响免疫细胞的浸润和功能。肿瘤坏死因子-α（TNF-α）：TNF-α 能够激活免疫系统，促进炎症反应，调节免疫细胞的浸润。TGF-β：在肿瘤微环境中，TGF-β 通过调节肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）和免疫抑制细胞的浸润，影响抗

细胞治疗是细胞和基因治疗的重要组成部分，它通过使用特定类型的细胞来修复、替换或调节受损的组织和器官。在细胞治疗中，不同类型的细胞因其独特的生物学特性而被广泛应用于多种疾病的治疗。以下是一些常用的细胞类型及其在细胞治疗中的应用。 （1）免疫细胞免疫细胞是细胞治疗中最重要且研究最多的细胞类型之一，主要包括 T 细胞、自然杀伤细胞（NK 细胞）和树突状细胞（DC 细胞）。T 细胞：T 细胞是人体免疫系统的核心细胞，具有强大的抗肿瘤能力。CAR-T 细胞疗法是目前最成功的免疫细胞治疗技术之一。它通过从患者体内提取 T 细胞，利用基因工程技术在 T 细胞表面嵌入嵌合抗原受体（CAR），使其能够特异性识别并攻击癌细胞。CAR-T 细胞疗法已在急性淋巴细胞白血病（ALL）、非霍奇金淋巴瘤（NHL）等血液肿瘤中取得了显著疗效。自然杀伤细胞（NK 细胞）：NK 细胞是先天免疫系统的一部分，具有天然的抗肿瘤和抗病毒感染能力。与 T 细胞不同，NK 细胞不需要预先激活即可直接识别并杀死肿瘤细胞。近年来，NK 细胞疗法在实体瘤治疗中展现出巨大潜力，尤其是在卵巢癌、乳腺癌和前列腺癌等疾病中。树突状细胞（DC 细

细胞和基因治疗（Cell and Gene Therapy，简称 CGT）是近年来生物医学领域最具革命性的前沿技术之一，它通过直接干预细胞和基因层面的病变，从源头上治疗疾病。与传统的小分子药物和大分子生物药不同，CGT 专注于遗传性或获得性疾病的根源，旨在通过修复、替换或调控异常基因或细胞，实现疾病的治疗、预防甚至治愈。 （1）定义与分类细胞和基因治疗是一种将遗传物质或细胞转移到患者体内以达到治疗效果的创新疗法。它主要分为两大类：细胞治疗和基因治疗。细胞治疗通常涉及从患者体内提取细胞，经过体外处理后再回输到患者体内，以发挥治疗作用。基因治疗则是通过基因编辑、基因添加或基因沉默等技术，直接修复或调控患者体内的异常基因。 （2）基本原理细胞和基因治疗的核心在于通过基因操作或细胞改造来纠正疾病的分子基础。例如，基因治疗可以通过以下几种方式实现：基因替代：用健康的基因替代缺陷基因，使细胞能够正常表达功能蛋白。基因修复：利用基因编辑技术（如 CRISPR-Cas9）直接修复突变基因。基因沉默：通过 RNA 干扰（RNAi）或反义寡核苷酸（ASO）技术抑制有害基因的表达。细胞治疗则主要利用免疫细胞

通过这个系列的视频，你将了解到：不同型号的层析柱的装填方法及操作要点，层析柱各部件的构造和功能等

HIS 标签蛋白纯化效果不理想，宝宝心里苦呀。今天，小编来跟大家一起找找原因。纯化所得组分中没有收集到重组的 HIS 标签蛋白。该问题主要可以分为以下两个方面：1、HIS 标签蛋白没有结合到填料上就流穿了原因一超声的功率不对。超声功率过高，容易导致蛋白炭化；功率过低，蛋白释放不出来。建议改变超声功率，同时可以在超声前加入溶菌酶。原因二结合缓冲液条件不合适。建议检查结合缓冲液中是否有影响结合的因素，如：金属离子螫合剂、强还原剂、过高的咪唑浓度。同时，优化缓冲液的 pH、盐离子浓度、添加剂（如 5% 甘油、1mM DTT) 等。原因三HIS 标签没有表达或丢失或暴露不充分。建议 1用 anti-HIS 的抗体进行 WB，检测 HIS 标签是否存在。建议 2将蛋白用 4-6M 盐酸胍或 4-8M 尿素变性后，让 HIS 标签充分暴露出来，看是否能与填料结合。建议 3改变 HIS 标签的位置或者增加其数目（常用 6-12 个 HIS），增加暴露和结合机会。建议 4改变金属结合离子，除了 Ni2+，Cu2+、Zn2+、Co2+ 也可以用来进行 HIS 标签的捕获。2、HIS标签蛋白结合了，但是洗

天然蛋白的特性可以说是迥然有异，每种蛋白都是不一样的烟火，共同特点就是丰度很低，自带丰富的背景杂质，并且没有特异性的纯化方法可循。然万物皆有共性，我们只需找到他们的共同点就可以求同存异，一切难题也就可以迎刃而解。凡是蛋白质都是氨基酸组成的，氨基酸既是两性电离物质又有多种多样的R 取代基，那么丰富的氨基酸组成就让不同蛋白质或多或少拥有带电性与疏水性。图1. 蛋白质结构示意图以上给我们的纯化提供了基础方案：以离子交换层析和疏水层析为核心步骤来开展。由于天然蛋白的复杂性，通常一步简单纯化很难达到我们的需求。事业已经成功了一半，另一半主要考验策略。成功有效纯化蛋白质的关键除了选择适宜的纯化技术，还要通过优化实验参数来达到要求的纯度，并且将各个纯化步骤以最合理的方式衔接起来，使用最少的纯化步骤，最少的劳动力，最经济的方案，达到蛋白质产量的最大化。图2. 蛋白质纯化技术流程图晋级之门已经开启，你的老板对你提出了三次公演的挑战！本攻略来教你如何乘风破浪。1、根据样品的初始条件选择离子交换或者疏水层析。如果样品初始处于低盐的缓冲液（中脱盐或缓冲液置换），就可以预判纯化使用的 pH 值，并选择离子交换层

采用亲和加分子筛两种层析方法就能得到大量高纯度的蛋白样品往往是别人家的实验。到自己手上总会有各种惊喜…今天的主角更加过分，在真正纯化之前就需要我们施展十八般武艺把它从细胞上「拽」下来。没错，它就是膜蛋白…人类基因组中，有大约 30% 的基因编码膜蛋白。当今已批准上市的药物中，有超过 50% 以膜蛋白为靶点，然而目前蛋白质结构数据库 (Protein Data Bank, PDB） 中膜蛋白比例不足 1%。欲了解其功能，必解析其结构。是很多结构生物学家心头的念念不忘，随着冷冻电镜技术的发展，会有更多的膜蛋白结构得到解析，助力后续的功能研究和药物发现。有了冷冻电镜这把利器之后，真正制约膜蛋白研究的其实是样品的制备。常规的膜蛋白制备流程如下：图 1.常规的膜蛋白制备流程图特点是：蛋白含量低收率低活性易降低纯化过程需要优化去垢剂天然表达的膜蛋白含量极低，很难纯化。就算是重组表达体系，生产出的膜蛋白通常具有细胞毒性，因此表达量也远低于常规重组蛋白。在整个纯化过程中都需要选择合适的去垢剂才能使膜蛋白本身保持空间构象和活性。去垢剂可分为三种：表 1.去垢剂类型和特点表常用的去垢剂大概有十几种，根据膜

复合模式层析原理复合模式层析是一种集合多种类型的相互作用（如离子交换、疏水、氢键、嗜硫亲和等）于一种层析介质从而同时具备高选择性和高分辨率的层析技术。图15 复合模式层析配基类型特点相较于传统层析模式具备更快的传质速率和更高的分辨率。在高回收率条件下实现有效分离。能够同时去除多种杂质，如多聚体、宿主蛋白、病毒、电荷异构体等。适用于难以同时去除多种痕量杂质的层析需求。层析介质目前Cytiva共有四款复合模式层析介质：Capto™ Adhere系列可有效应用于两步法抗体纯化的精纯步骤。Capto™ MMC系列可直接用于发酵液的高盐上样，有效简化步骤，降低成本。Capto™ Core系列广泛应用于病毒、病毒样颗粒、病毒载体、外泌体等大粒径蛋白分离中。不同层析介质之间的比较1. Capto™ Core400 & Capto™ Core700Capto™ Core是一种具有独特双层结构的多模式填料。其外层是5µm的钝化层，屏蔽了所有的结合位点并精准控制孔径。分子量大于700kDa或400kDa的生物大分子不能进入填料内部。其内层是多模式配基辛胺基，可吸附进入内部的蛋白质、核酸等物质。图1

疏水相互作用层析原理疏水作用层析原理是根据生物分子的疏水性差异进行分离。当生物分子通过疏水作用层析介质的时候，生物分子的疏水基团与层析介质的疏水配基相互作用，之后通过降低缓冲液的疏水性来进行洗脱，从而使生物分子通过疏水作用产生分离，纯化获得目标样品。特色属于其他层析技术的互补技术高选择性，特别适用于疏水性高的目的物分离纯化由于需要高盐条件，易使蛋白沉淀、变性，因此其应用范围受限属于吸附性层析类型，具有浓缩作用操作环境的温度对层析过程及结果的影响较大适于疏水性强的蛋白、耐高盐蛋白的分离基本步骤疏水作用层析作为一种吸附性层析，主要步骤包括平衡、上样、清洗、洗脱和再生步骤。疏水作用层析一般在高盐环境中上样，经过上样和清洗之后，通过降低洗脱液中的盐浓度逐渐对不同的分子进行洗脱。其流程可参考下图（图13）：图13 疏水作用层析流程图填料选择疏水填料和离子交换填料类似，都是由基架和疏水配基交联而成，常见的疏水填料配基有 Phenyl、Butyl、Octyl 等，常见疏水填料强弱如图所示：图14 常见疏水填料强弱图疏水性强弱，在实验初期，一般先使用疏水性最强的疏水填料（如 Phenyl 填料）进行条

亲和层析原理亲和层析是一种通过生物分子之间的特异性相互作用来分离物质的层析方法，如酶和底物、抗原与抗体等非常专一的相互作用 （图9)。配基被固定在填料上，可以结合相应的生物分子，再采用合适的方法如降低pH值、离子强度等，或添加和配基或者目的分子类似的基团，使目标分子以活性的形式被洗脱。图9 亲和层析原理特点速度快，操作简单，可以快速将目标蛋白与大量杂质进行分离特异性高，经常一步即可达到大于90%的纯度配基种类繁多，填料选择性高 （包括纯化标签抗体蛋白、抗体、酶类、DNA结合蛋白等）可以完成一般方法很难完成的分离，如变性和非变性蛋白、功能不同的蛋白的分离属于一种吸附层析，载量高，具有高效的捕获和浓缩作用。基本步骤亲和层析作为一种吸附性层析，主要步骤包括平衡、上样、清洗、洗脱和再平衡步骤 （图10)。由于亲和作用需要在特定的条件下结合和洗脱，亲和层析需要使用特定的结合缓冲液和洗脱缓冲液。图10 亲和层析的基本步骤适用性带有标签的融合蛋白纯化，如His标签蛋白、GST标签蛋白等。抗体及抗体片段的纯化其他和某些配基有特异性结合作用的分子的纯化填料根据亲和层析的几种应用方向，亲和层析的填料主要分

凝胶过滤层析原理凝胶过滤层析是根据分子大小和形状的差异进行分离的一种简单可靠的层析技术。当生物分子通过凝胶过滤填料时，分子量大的生物分子只能通过大的孔径，小分子量的生物分子会经过小的孔径，因此和大分子量的生物分子相比，小分子量的生物分子经过的路程会更长。凝胶过滤层析的全过程只用一种缓冲液即可将不同分子量的生物分子进行分离。特点填料主要为惰性（无反应性或吸附性）的球状疏松多孔颗粒，具有均匀的分离范围目标分子不与介质结合，通常仅需一种缓冲液缓冲液成分不直接影响分辨率（即峰之间的分离程度），可以根据样品的稳定性选择相应的缓冲液，非常适合对 pH 变化、金属离子或辅助因子浓度以及大环境情况敏感的生物分子对装柱效果要求较高，一般推荐使用预装柱上样体积一般为特定比例的柱体积，上样体积相对受限基本步骤凝胶过滤层析为非吸附性层析，实验步骤主要包括平衡、上样、洗脱三步（图8）。1.平衡：使用相应的缓冲液冲洗层析柱，使层析柱平衡至所需的实验条件中。2.上样：将合适体积的样品通过样品环等容器加入层析柱中。3.洗脱：使用平衡缓冲液冲洗层析柱，使加入层析柱的样品逐渐被分开并洗脱到不同的组分中。图8 凝胶过滤层析

离子交换层析原理离子交换层析是根据生物分子的带电荷差异进行分离的一种吸附性层析。当生物分子通过离子交换层析介质的时候，带电荷的分子和层析填料上的相反电荷之间产生静电吸附，这是一种可逆的相互作用，在使用缓冲液洗脱时，不同电荷数量的生物分子，其洗脱缓冲液的浓度不同，从而使生物分子通过离子交换层析介质后得到分离的效果。特点介质种类繁多，具有高选择性pH是离子交换层析至关重要的参数，pH的不同会导致整个实验结果的差异操作简单，易于控制属于吸附性层析，通常载量很高，具有浓缩作用洗脱方式简单温和，通常采用盐离子梯度方式进行洗脱，少数情况使用pH梯度洗脱回收率高基本步骤离子交换层析作为一种吸附性层析，主要步骤包括平衡、上样、清洗、洗脱和再生步骤 （图6)。离子交换层析一般在特定pH的低盐缓冲液中进行上样，经过上样和清洗之后，通过增加洗脱液中的盐浓度逐渐对不同的分子进行洗脱。图1 离子交换层析的基本步骤适用性离子交换层析适用于所有类型的目标分子 （如蛋白质、核酸、多糖、疫苗、病毒等），也适用于纯化从捕获到中度纯化到精纯的所有步骤以及小试、中试、放大等所有规模。填料离子交换层析填料主要有基架和配基两部分

通过本视频，您将了解到不同蛋白标签的特点，也将学习带有不同标签的重组蛋白的层析纯化策略与方法。

纯化达人成长记之凝胶过滤实验的层析原理解析，帮助您更好地理解不同的凝聚过滤应用，解答您在凝聚过滤实验中的常见问题。

在掌握各类层析技术的原理、实验步骤、常见应用及成功技巧的基础上，通过科学设计纯化流程，可以在确保高纯度样品的同时兼顾回收率，详见 CIPP 纯化三部曲的精细解读。

‌FcR阻断剂，‌让流式实验中的干扰无处遁形说到Fc阻断，就不得不提到抗体。抗体的结构分为Fab和Fc段，Fab段是与目标分子特异性结合的区域，Fc段是Ig与效应分子或者细胞相互作用的部位[1]（图1）。Fc受体（Fragment Crystallizable Receptor，FcR）是免疫调节受体中非常重要的受体，主要在先天免疫细胞上表达，能被抗体的Fc段识别并结合，从而引发免疫应答。图1：抗体结构为什么要做Fc阻断?在细胞学实验中，正确区分阳性和阴性细胞十分重要。获得良好的阳性细胞群，得益于抗体的特异性结合，但是多数免疫细胞表面都会表达FcR，并且与抗体的Fc段有不同程度的亲和力。因此，抗体Fc段会非特异结合细胞FcR（图2），在流式图中便会出现一群本不应该存在的非特异性细胞群（图3）。值得注意的是，这种非特异性结合的信号，并不会因为同型对照的使用而被扣除掉，容易导致在流式分析中出现背景增高甚至假阳性信号的结果。图2：抗体与细胞结合的示意图图3：FcR block流图对比哪些实验需要考虑Fc阻断？从广义上来讲，任何涉及抗原抗体反应的实验，涉及到的细胞类型表达FcR，同时反应抗体含

低至单个细胞的DNA/RNA共提取方案，起始样本支持显微切割细胞、流式分选细胞、循环肿瘤细胞（CTCs）、胎儿细胞、干细胞、T细胞等。