通过这个系列的视频，你将了解到：不同型号的层析柱的装填方法及操作要点，层析柱各部件的构造和功能等

HIS 标签蛋白纯化效果不理想，宝宝心里苦呀。今天，小编来跟大家一起找找原因。纯化所得组分中没有收集到重组的 HIS 标签蛋白。该问题主要可以分为以下两个方面：1、HIS 标签蛋白没有结合到填料上就流穿了原因一超声的功率不对。超声功率过高，容易导致蛋白炭化；功率过低，蛋白释放不出来。建议改变超声功率，同时可以在超声前加入溶菌酶。原因二结合缓冲液条件不合适。建议检查结合缓冲液中是否有影响结合的因素，如：金属离子螫合剂、强还原剂、过高的咪唑浓度。同时，优化缓冲液的 pH、盐离子浓度、添加剂（如 5% 甘油、1mM DTT) 等。原因三HIS 标签没有表达或丢失或暴露不充分。建议 1用 anti-HIS 的抗体进行 WB，检测 HIS 标签是否存在。建议 2将蛋白用 4-6M 盐酸胍或 4-8M 尿素变性后，让 HIS 标签充分暴露出来，看是否能与填料结合。建议 3改变 HIS 标签的位置或者增加其数目（常用 6-12 个 HIS），增加暴露和结合机会。建议 4改变金属结合离子，除了 Ni2+，Cu2+、Zn2+、Co2+ 也可以用来进行 HIS 标签的捕获。2、HIS标签蛋白结合了，但是洗

天然蛋白的特性可以说是迥然有异，每种蛋白都是不一样的烟火，共同特点就是丰度很低，自带丰富的背景杂质，并且没有特异性的纯化方法可循。然万物皆有共性，我们只需找到他们的共同点就可以求同存异，一切难题也就可以迎刃而解。凡是蛋白质都是氨基酸组成的，氨基酸既是两性电离物质又有多种多样的R 取代基，那么丰富的氨基酸组成就让不同蛋白质或多或少拥有带电性与疏水性。图1. 蛋白质结构示意图以上给我们的纯化提供了基础方案：以离子交换层析和疏水层析为核心步骤来开展。由于天然蛋白的复杂性，通常一步简单纯化很难达到我们的需求。事业已经成功了一半，另一半主要考验策略。成功有效纯化蛋白质的关键除了选择适宜的纯化技术，还要通过优化实验参数来达到要求的纯度，并且将各个纯化步骤以最合理的方式衔接起来，使用最少的纯化步骤，最少的劳动力，最经济的方案，达到蛋白质产量的最大化。图2. 蛋白质纯化技术流程图晋级之门已经开启，你的老板对你提出了三次公演的挑战！本攻略来教你如何乘风破浪。1、根据样品的初始条件选择离子交换或者疏水层析。如果样品初始处于低盐的缓冲液（中脱盐或缓冲液置换），就可以预判纯化使用的 pH 值，并选择离子交换层

采用亲和加分子筛两种层析方法就能得到大量高纯度的蛋白样品往往是别人家的实验。到自己手上总会有各种惊喜…今天的主角更加过分，在真正纯化之前就需要我们施展十八般武艺把它从细胞上「拽」下来。没错，它就是膜蛋白…人类基因组中，有大约 30% 的基因编码膜蛋白。当今已批准上市的药物中，有超过 50% 以膜蛋白为靶点，然而目前蛋白质结构数据库 (Protein Data Bank, PDB） 中膜蛋白比例不足 1%。欲了解其功能，必解析其结构。是很多结构生物学家心头的念念不忘，随着冷冻电镜技术的发展，会有更多的膜蛋白结构得到解析，助力后续的功能研究和药物发现。有了冷冻电镜这把利器之后，真正制约膜蛋白研究的其实是样品的制备。常规的膜蛋白制备流程如下：图 1.常规的膜蛋白制备流程图特点是：蛋白含量低收率低活性易降低纯化过程需要优化去垢剂天然表达的膜蛋白含量极低，很难纯化。就算是重组表达体系，生产出的膜蛋白通常具有细胞毒性，因此表达量也远低于常规重组蛋白。在整个纯化过程中都需要选择合适的去垢剂才能使膜蛋白本身保持空间构象和活性。去垢剂可分为三种：表 1.去垢剂类型和特点表常用的去垢剂大概有十几种，根据膜

复合模式层析原理复合模式层析是一种集合多种类型的相互作用（如离子交换、疏水、氢键、嗜硫亲和等）于一种层析介质从而同时具备高选择性和高分辨率的层析技术。图15 复合模式层析配基类型特点相较于传统层析模式具备更快的传质速率和更高的分辨率。在高回收率条件下实现有效分离。能够同时去除多种杂质，如多聚体、宿主蛋白、病毒、电荷异构体等。适用于难以同时去除多种痕量杂质的层析需求。层析介质目前Cytiva共有四款复合模式层析介质：Capto™ Adhere系列可有效应用于两步法抗体纯化的精纯步骤。Capto™ MMC系列可直接用于发酵液的高盐上样，有效简化步骤，降低成本。Capto™ Core系列广泛应用于病毒、病毒样颗粒、病毒载体、外泌体等大粒径蛋白分离中。不同层析介质之间的比较1. Capto™ Core400 & Capto™ Core700Capto™ Core是一种具有独特双层结构的多模式填料。其外层是5µm的钝化层，屏蔽了所有的结合位点并精准控制孔径。分子量大于700kDa或400kDa的生物大分子不能进入填料内部。其内层是多模式配基辛胺基，可吸附进入内部的蛋白质、核酸等物质。图1

疏水相互作用层析原理疏水作用层析原理是根据生物分子的疏水性差异进行分离。当生物分子通过疏水作用层析介质的时候，生物分子的疏水基团与层析介质的疏水配基相互作用，之后通过降低缓冲液的疏水性来进行洗脱，从而使生物分子通过疏水作用产生分离，纯化获得目标样品。特色属于其他层析技术的互补技术高选择性，特别适用于疏水性高的目的物分离纯化由于需要高盐条件，易使蛋白沉淀、变性，因此其应用范围受限属于吸附性层析类型，具有浓缩作用操作环境的温度对层析过程及结果的影响较大适于疏水性强的蛋白、耐高盐蛋白的分离基本步骤疏水作用层析作为一种吸附性层析，主要步骤包括平衡、上样、清洗、洗脱和再生步骤。疏水作用层析一般在高盐环境中上样，经过上样和清洗之后，通过降低洗脱液中的盐浓度逐渐对不同的分子进行洗脱。其流程可参考下图（图13）：图13 疏水作用层析流程图填料选择疏水填料和离子交换填料类似，都是由基架和疏水配基交联而成，常见的疏水填料配基有 Phenyl、Butyl、Octyl 等，常见疏水填料强弱如图所示：图14 常见疏水填料强弱图疏水性强弱，在实验初期，一般先使用疏水性最强的疏水填料（如 Phenyl 填料）进行条

亲和层析原理亲和层析是一种通过生物分子之间的特异性相互作用来分离物质的层析方法，如酶和底物、抗原与抗体等非常专一的相互作用 （图9)。配基被固定在填料上，可以结合相应的生物分子，再采用合适的方法如降低pH值、离子强度等，或添加和配基或者目的分子类似的基团，使目标分子以活性的形式被洗脱。图9 亲和层析原理特点速度快，操作简单，可以快速将目标蛋白与大量杂质进行分离特异性高，经常一步即可达到大于90%的纯度配基种类繁多，填料选择性高 （包括纯化标签抗体蛋白、抗体、酶类、DNA结合蛋白等）可以完成一般方法很难完成的分离，如变性和非变性蛋白、功能不同的蛋白的分离属于一种吸附层析，载量高，具有高效的捕获和浓缩作用。基本步骤亲和层析作为一种吸附性层析，主要步骤包括平衡、上样、清洗、洗脱和再平衡步骤 （图10)。由于亲和作用需要在特定的条件下结合和洗脱，亲和层析需要使用特定的结合缓冲液和洗脱缓冲液。图10 亲和层析的基本步骤适用性带有标签的融合蛋白纯化，如His标签蛋白、GST标签蛋白等。抗体及抗体片段的纯化其他和某些配基有特异性结合作用的分子的纯化填料根据亲和层析的几种应用方向，亲和层析的填料主要分

凝胶过滤层析原理凝胶过滤层析是根据分子大小和形状的差异进行分离的一种简单可靠的层析技术。当生物分子通过凝胶过滤填料时，分子量大的生物分子只能通过大的孔径，小分子量的生物分子会经过小的孔径，因此和大分子量的生物分子相比，小分子量的生物分子经过的路程会更长。凝胶过滤层析的全过程只用一种缓冲液即可将不同分子量的生物分子进行分离。特点填料主要为惰性（无反应性或吸附性）的球状疏松多孔颗粒，具有均匀的分离范围目标分子不与介质结合，通常仅需一种缓冲液缓冲液成分不直接影响分辨率（即峰之间的分离程度），可以根据样品的稳定性选择相应的缓冲液，非常适合对 pH 变化、金属离子或辅助因子浓度以及大环境情况敏感的生物分子对装柱效果要求较高，一般推荐使用预装柱上样体积一般为特定比例的柱体积，上样体积相对受限基本步骤凝胶过滤层析为非吸附性层析，实验步骤主要包括平衡、上样、洗脱三步（图8）。1.平衡：使用相应的缓冲液冲洗层析柱，使层析柱平衡至所需的实验条件中。2.上样：将合适体积的样品通过样品环等容器加入层析柱中。3.洗脱：使用平衡缓冲液冲洗层析柱，使加入层析柱的样品逐渐被分开并洗脱到不同的组分中。图8 凝胶过滤层析

离子交换层析原理离子交换层析是根据生物分子的带电荷差异进行分离的一种吸附性层析。当生物分子通过离子交换层析介质的时候，带电荷的分子和层析填料上的相反电荷之间产生静电吸附，这是一种可逆的相互作用，在使用缓冲液洗脱时，不同电荷数量的生物分子，其洗脱缓冲液的浓度不同，从而使生物分子通过离子交换层析介质后得到分离的效果。特点介质种类繁多，具有高选择性pH是离子交换层析至关重要的参数，pH的不同会导致整个实验结果的差异操作简单，易于控制属于吸附性层析，通常载量很高，具有浓缩作用洗脱方式简单温和，通常采用盐离子梯度方式进行洗脱，少数情况使用pH梯度洗脱回收率高基本步骤离子交换层析作为一种吸附性层析，主要步骤包括平衡、上样、清洗、洗脱和再生步骤 （图6)。离子交换层析一般在特定pH的低盐缓冲液中进行上样，经过上样和清洗之后，通过增加洗脱液中的盐浓度逐渐对不同的分子进行洗脱。图1 离子交换层析的基本步骤适用性离子交换层析适用于所有类型的目标分子 （如蛋白质、核酸、多糖、疫苗、病毒等），也适用于纯化从捕获到中度纯化到精纯的所有步骤以及小试、中试、放大等所有规模。填料离子交换层析填料主要有基架和配基两部分

通过本视频，您将了解到不同蛋白标签的特点，也将学习带有不同标签的重组蛋白的层析纯化策略与方法。

纯化达人成长记之凝胶过滤实验的层析原理解析，帮助您更好地理解不同的凝聚过滤应用，解答您在凝聚过滤实验中的常见问题。

在掌握各类层析技术的原理、实验步骤、常见应用及成功技巧的基础上，通过科学设计纯化流程，可以在确保高纯度样品的同时兼顾回收率，详见 CIPP 纯化三部曲的精细解读。

‌FcR阻断剂，‌让流式实验中的干扰无处遁形说到Fc阻断，就不得不提到抗体。抗体的结构分为Fab和Fc段，Fab段是与目标分子特异性结合的区域，Fc段是Ig与效应分子或者细胞相互作用的部位[1]（图1）。Fc受体（Fragment Crystallizable Receptor，FcR）是免疫调节受体中非常重要的受体，主要在先天免疫细胞上表达，能被抗体的Fc段识别并结合，从而引发免疫应答。图1：抗体结构为什么要做Fc阻断?在细胞学实验中，正确区分阳性和阴性细胞十分重要。获得良好的阳性细胞群，得益于抗体的特异性结合，但是多数免疫细胞表面都会表达FcR，并且与抗体的Fc段有不同程度的亲和力。因此，抗体Fc段会非特异结合细胞FcR（图2），在流式图中便会出现一群本不应该存在的非特异性细胞群（图3）。值得注意的是，这种非特异性结合的信号，并不会因为同型对照的使用而被扣除掉，容易导致在流式分析中出现背景增高甚至假阳性信号的结果。图2：抗体与细胞结合的示意图图3：FcR block流图对比哪些实验需要考虑Fc阻断？从广义上来讲，任何涉及抗原抗体反应的实验，涉及到的细胞类型表达FcR，同时反应抗体含

低至单个细胞的DNA/RNA共提取方案，起始样本支持显微切割细胞、流式分选细胞、循环肿瘤细胞（CTCs）、胎儿细胞、干细胞、T细胞等。

研究背景 使用程序性死亡-1抑制剂或其配体（抗PD-1/PD-L1）的免疫检查点阻断 (ICB) 疗法已成为治疗许多癌症的有效方法。然而仅有少数患者对ICB疗法表现出长期良好的反应，大多数患者对免疫检查点阻断剂都没有阳性反应或因为阻断剂的不良反应而不得不停止服用。虽然已经发现了许多类别的生物标志物，但目前仍未发现强有力的治疗反应预测标志物。寻求新的ICB反应的非侵入性生物标志物能大大提高ICB疗法的临床效果。研究内容及结果 2020年9月，在Nature子刊Nature Cancer(IF=23.5/中科院一区)杂志上发表的题为 Personalized circulating tumor DNA analysis as a predictive biomarker in solid tumor patients treated with pembrolizumab的研究成果发现肿瘤释放到血液中的循环肿瘤DNA（ctDNA）的水平变化能够预测患者的免疫治疗疗效[1]。这项发现无疑为免疫治疗打开了新的突破口。该研究团队发起了一项包括头颈部鳞状细胞癌 (SCCHN)、三阴性乳腺癌 (TNB

低至单个细胞的DNA&mRNA共提取方案，起始样本支持显微切割细胞、流式分选细胞、循环肿瘤细胞（CTCs）、胎儿细胞、干细胞、T细胞等。

荧光定量PCR 技术可以实现RNA 的相对定量，广泛应用于分子生物学研究及疾病相关研究。QIAGEN QuantiNova PCR系列可支持包括一步法、多重等多种qPCR应用；超快速的反应体系30min即可完成实验及独特的颜色指示方案杜绝加样错误；LNA（锁核酸）技术加持增强引物或探针的灵敏度和特异性。

环境核酸是生物与环境互作遗留的核酸，来源包括生物脱落的组织、分泌物、排泄物、血液或尸体等，分布在各种水体、土壤、沉积物或空气等环境中，是微生物和脱落DNA的混合物,这两类核酸在上述环境样本中存在较少。

从微量样本中分离 RNA，微量样本包括：微量细胞样本如低至 1 个细胞、流式分选细胞（FACS）样本；微量组织样本如低于2 μg的组织样本如穿刺样本（FNA）、激光显微切割（LMD）样本等。

从微量样本中提取DNA。微量样本包括：微量血液样本，如低至1 μl全血；微量细胞样本，可低至100个细胞，如显微切割细胞、流式分选细胞等；或小于10 mg组织，如穿刺样本、活检样本；以及骨骼或化石等疑难样本。