抗体_从蛋黄中快速纯化 IgY 的新方法

利用禽源生产抗体有以下优点：首先，对母鸡进行免疫后，血清和蛋黄中都会产生相似浓度的特异性抗体。其次，与收集血液相比，收集和储存鸡蛋更容易，每周几个鸡蛋产生的抗体量足以媲美反复收集免疫兔血液所得到的抗体量。由于进化差异，高度保守、弱免疫原性的哺乳动物抗原也可使禽类产生较高水平的抗体应答。本文提出了一种在亲硫作用层析法基础上，使用  HiTrap IgY Purification HP 层析柱和 Superdex 200 10/300 GL 从蛋黄中纯化 IgY 的实验方法。

HiTrap IgY Purification HP 层析柱装填由高性能 Sepharose 基架和亲硫吸附的 2-巯基吡啶配基组成的填料。前人研究表明，IgY 和配基的相互作用是配基的供电子基和吸电子基的联合作用或同时存在亲水－疏水性相互作用的混合模式所引起。

从蛋黄中纯化获得 IgY

1.样品制备

从蛋清中分离蛋黄并收集。每个蛋黄的体积约为 20mL。以下两种提取方法任选其一来沉淀存在于蛋黄中的大部分脂质。

水提取法：将蛋黄用超纯水按照 1:9 比例进行稀释，在 4°C 下缓慢搅拌 6 小时后，离心（10000×g，25 min，4°C）沉淀脂质，收集含 IgY 的上清液。

PEG 6000 提取法：一份蛋黄用 3 份 0.1 M 磷酸钠缓冲液（pH 7.5）和 1 份含 17.5%PEG 的 0.1 M 磷酸钠缓冲液（pH 7.5）稀释，得到最终浓度 3.5% 的 PEG 混合样品溶液。在室温下缓慢搅拌 20 min 后，使用台式离心机离心（3000rpm，25 min，室温）沉淀脂质，收集所得含 IgY  的上清液，并通过粗滤纸过滤，以除去残留颗粒。

在将上述任一方法得到的提取物上样至 HiTrap IgY Purification HP 层析柱上之前，加入硫酸钾至最终浓度为 0.5M，然后将 pH 值调节至 7.5，并用 0.45μm 滤器过滤样品。

2.纯化和分析

2.1 HiTrap IgY Purification HP

水溶液中一定浓度的盐可促进亲硫吸附，经测定，在亲硫吸附填料（HiTrap IgY Purification HP）上 IgY 纯化的最佳吸附缓冲液条件为含 0.5M 硫酸钾的 20 mM 磷酸钠缓冲液。

纯化条件：

层析柱：HiTrap IgY Purification HP 5 mL
样品：50 mL蛋黄水提取液（相当于1/4个蛋黄）
结合缓冲液：20 mM 磷酸钠，0.5M 硫酸钾，pH7.5
洗脱缓冲液：20mM 磷酸钠，pH7.5
清洗缓冲液：20mM 磷酸钠，30% 异丙醇，pH7.5
流速：5 ml/min
系统：ÄKTA explorer 10S

2.2 凝胶过滤

HiTrap IgY Purification HP 获得的混合洗脱液可在 HiLoad 16/600 Superdex 200 pg 上经凝胶过滤进一步纯化。通过  Superdex 200 10/300 GL 层析柱上的分析凝胶过滤判断，HiTrap IgY洗脱液中 IgY 的纯度约为 70%。

纯化条件：

层析柱：Superdex 200 10/300 GL

样品：200μL HiTrap IgY Purification HP 洗脱液

缓冲液：50 mM 磷酸钠，0.15 M 氯化钠，pH7.5

流速：0.5 ml/min

系统：ÄKTA explorer 10S

实验结果

1、HiTrap IgY Purification HP 纯化

2、凝胶过滤纯化