材料与仪器
器材：高速离心机，涡旋振荡器
试剂：Solution A2 （-18℃保存）_48 mL，Solution B （常温保存）_12 mL，1×PBS缓冲液（无菌）、Umibio 外泌体提取试剂盒（组织）
耗材：1.5 mL、2 mL 离心管， Exosome Purification Filter _20_Tubes~K~Hp~M
步骤
一、样品预处理
1、提前将 Solution A2 置于 4 ℃ 或冰上融化并混匀；
2、组织剪碎：在消毒器皿（置于冰上）中将组织剪切成 1 mm3～3 mm3 左右的碎组织块（剪切得越小越好）；
3、组织碎片清洗：将组织碎块转移至离心管中，加入不少于 10 倍体积的 1 × PBS 缓冲液， 振荡混匀后 300 ×g（~2000 rpm）离心 10 min， 弃上清；
4、组织消化：按照每 0.1 g 组织块加入 1 mL Solution A2 的比例，将组织块与 Solution A2 混匀在 2 mL 离心管中，横放于 37℃、80 rpm 恒温摇床上孵育 20 min（或在 37℃ 水浴锅中孵育 30 min，每 5 min混匀一次）；
5、离心取上清：反应液以 8,000 ×g（~10,100 rpm）离心 10 min，将上清液转移至新的离心管中；
6、离心去杂质碎片：将离心上清液转移至新的离心管中，于 4℃ 以 12,000 ×g（~12,400 rpm）离心 10 min，去除样品中的杂质碎片；
7、上清液转移：去除杂质碎片的上清液转移到新离心管中。
二、 外泌体提取纯化
1、加 Solution B2 试剂：上一步获得的上清液中加入 1/4 体积的 Solution B2 试剂；
2、溶液混合： 将离心管盖紧，通过涡旋振荡器混匀 1 min，再放置于 4℃ 静置 1 h 以上（注：增加静置时间可提高外泌体得率，但不可超过 24 h）；
3、沉淀外泌体：取出装有混合液的离心管于 4℃ 以 12,000 ×g（~12,400 rpm）离心 30 min，弃上清，沉淀中富含外泌体颗粒（尽可能吸尽上清液）；
4、再次离心：将含有沉淀的离心管再次于 4℃ 以 12,000 ×g（~12,400 rpm）离心 2 min，弃上清（注：尽可能吸尽上清液）；
5、外泌体重悬：取合适量的 1×PBS 均匀吹打离心沉淀物，待其溶解后，将重悬液转移至新的 1.5 mL 离心管中（建议每 0.1 g 组织用 200 μL 左右 1×PBS 重悬）；
6、收获外泌体颗粒： 将含有重悬液的 1.5 mL 离心管于 4℃ 以 12,000 ×g（~12,400 rpm） 离心 2 min，保留上清液，该上清液中富含外泌体颗粒（注：若沉淀较多，可12,000 ×g，2 min 离心多次至无明显沉淀，每次取上清液）。
三、外泌体纯化
1、纯化外泌体 ：将收获的外泌体颗粒粗品转入 Exosome Purification Filter（EPF 柱）上室中，于 4℃ 以 3,000 ×g（~6,200 rpm）离心 10 min，离心后收集 EPF 柱管底的液体，此液体即为纯化后的外泌体颗粒（注：EPF 柱不可重复使用）；
2、外泌体的保存：纯化后的外泌体以合适体积进行分装冻存于 -80℃ 低温冰箱中，以备后续实验使用。
常见问题
一、产品试剂保存问题
1、Solution A2 使用前后应保存于 -18℃ 条件下，建议分装后使用，应避免反复冻融；
2、Solution B2 始终保存在室温条件下即可，温度过低可能使该溶液中出现白色结晶，且难以复溶（需要高温），少量沉淀不影响提取效果。
二、纯化柱使用问题
1、一般情况下，每个样品按照说明书操作，3,000 ×g（~6,200 rpm）离心 10 min ，即可一次性纯化完毕。如果上柱中仍有液体残留，将纯化柱转换方向放置于离心机中（区别于上一次放置方向即可），再次重复离心；
2、若通过上述操作，上柱中仍有较多液体残留，请将上柱中的液体转移至新的纯化柱中，继续重复离心操作，直至上柱液体全部转移至下柱中。
三、外泌体得率问题
一般情况下，0.1 g 组织样品（以心肌组织为例）可以提取出 100~200 μg 外泌体（5E+9~1E+10 Particles 总量），因不同组织外泌体含量不同，得率会有一定差异。
来源：丁香实验
