蛋白过镍柱纯化

在重组蛋白表达纯化的过程中 His-Tag 是最为常见的标签，对于大多数蛋白（可溶或包涵体）都可以使用该方法进行初步的纯化。

Ni²⁺ 能够螯合配体填充并固定在层析介质上，组氨酸（His）带有一个咪唑基团，该基团能够与 Ni²⁺ 形成配位键并选择性结合，而不带有 His 残基的蛋白不能与 Ni²⁺ 形成配位键并结合，这样便能有效地将目的蛋白（具有 His-Tag 的蛋白）与非目的蛋白进行有效区分。

随后通过高浓度的咪唑缓冲液与 His-Tag 竞争结合 Ni²⁺，将目的蛋白洗脱并进行收集，从而得到较为纯净的目的蛋白。

纯化带有 His 标记的目的蛋白。

Ni²⁺ 亲和柱、0.2 M NiSO₄ 溶液

100 mM EDTA 溶液、0.2 M NaOH 溶液

ddH₂O、0.22 μm 滤膜

结合缓冲液：低浓度咪唑缓冲液

洗脱缓冲液：高浓度咪唑缓冲液等

1、Ni²⁺ 亲和柱的重生

1）将 Ni²⁺ 亲和柱接在泵头上，使用 ddH₂O 冲洗 5 个柱体积。

2）随后更换为 EDTA 溶液冲洗 5 个柱体积，使用 ddH₂O 冲洗 5 个柱体积。

3）使用 0.2 M NaOH 溶液冲洗 5 个柱体积，使用 ddH₂O 冲洗 10 个柱体积。

4）使用 NiSO₄ 溶液填充亲和柱，冲洗 5 个柱体积，使用 ddH₂O 冲洗 5 个柱体积。

以上 Ni²⁺ 亲和柱重生完毕。

2、Ni²⁺ 亲和柱的平衡

将 Ni²⁺ 亲和柱接在泵头上，使用低浓度咪唑盐缓冲液冲洗 5 个柱体积。

3、带有 His-Tag 的目的蛋白与 Ni²⁺ 亲和柱结合

1）将表达蛋白的菌液放入高速离心机离心，5000 rpm、4 °C、10 分钟，收集菌块，-20 ℃ 或 -80 ℃ 冻存备用。

2）使用低浓度咪唑缓冲液将菌块重悬。

3）在冰浴条件下，使用压力破碎仪或超声破碎仪释放表达的蛋白，超声破碎仪不尽相同需优化实验条件。若超声后菌液依然浑浊，需适当增加功率，延长超声时间。

4）将悬液置于超高速离心机中，4 °C，18000 rpm，25 分钟，分离上层蛋白清液和沉淀。

5）SDS-PAGE 电泳检测：确定蛋白是可溶性（上清）表达还是包涵体（沉淀）表达。

6）Ni²⁺ 亲和柱接在泵头上，在 4 °C 条件下将蛋白裂解液慢速恒速通过Ni²⁺ 亲和柱。

7）使用低浓度咪唑缓（10 mM 咪唑）冲液 2~5 mL/min 流过 Ni²⁺ 亲和柱，约 5 个柱体积。

8）用分别含 50、100、200、300、400 mM 咪唑缓冲液进行阶段洗脱，流速为 2~5 mL/min，收集各阶段洗脱峰，每个浓度咪唑缓冲液流过 2 个柱体积。

9）收集得到蛋白样品用 SDS-PAGE 检测融合蛋白的分子量大小和纯度。

10）用 ddH₂O 冲洗 Ni²⁺ 亲和柱 5 个柱体积，再用 20% 的乙醇冲洗 Ni²⁺ 亲和柱 3 个柱体积，流速为 2~5 mL/min，柱子始终置于低温环境中保存。

11）对 SDS-PAGE 检测得到的高纯度蛋白进行浓缩，并在短时间内进行缓冲液置换和下一步纯化实验。

1. 在设计重组蛋白时通常建议在 C 端或 N 端添加 6 个 His-Tag 标签，确保表达质粒构建成功且 IPTG 诱导重组菌表达的浓度合适，设计预实验判定后进行正式实验。

2. His-Tag 的分子量非常小，几乎不会影响目的蛋白的高级结构。

3. His-Tag 往往被设计在 N 端，这样与细菌的转录机制能够更好的兼容。

4. 如果实验室条件较好，可以应用 ÄKTA^TM 系统进行蛋白的自动纯化。

5. 所用到的缓冲液都应该过 0.22 μm 滤膜。

6. 蛋白在高浓度咪唑盐中保存往往会变形，应该尽快进行下一步实验或进行缓冲液置换。

7. 缓冲液配方多样，常用 pH 7.4 的 PBS 溶液加不同浓度的咪唑盐。

8. 实验室没有超高速离心机，可以使用 0.45 μm 滤膜过滤压力破菌仪或超声破菌仪释放表达的蛋白悬液。

9. 柱子长时间不用应将内部的 Ni²⁺ 洗脱干净，并使用 20% 乙醇溶液进行冷藏保存，防止微生物生长。

10. 每次填充的 Ni²⁺ 亲和柱使用三次后应当再次重生，以提高纯化效率。

11. 需设计预确定蛋白是可溶性（上清）表达还是包涵体（沉淀）表达。

1.蛋白不挂柱

1）首先判断目的蛋白是否具有良好的水溶性，如果目的蛋白水溶性较差，建议添加 MBP 标签增加蛋白的水溶性。

2）可能在裂菌的过程中蛋白没有完全释放，可以增大压力、超声的功率或者破菌时间以及添加适量的溶菌酶。

3）上层蛋白清液应用较慢的流速恒流通过 Ni²⁺ 亲和柱，可以循环挂柱 2~3 次。

4）His-Tag 没有完全暴露，可以在裂菌过程中添加 1% 甘油或 2~5 mM DTT/β-巯基乙醇，使得 His-Tag 充分暴露。

2. 目的蛋白洗脱不下来

提高洗脱液中 Ni²⁺ 的浓度，或增加 NaCl 和非离子去污剂的浓度。注意高浓度 NaCl 可能会引起蛋白质的变性。

3. 在 SDS-PAGE 检测过程中发现杂蛋白条带较多

1）提高低浓度咪唑缓冲液的咪唑浓度。

2）使用多标签多步纯化，例如添加 MBP-Tag 标签即可使用 MBP 亲和柱进行进一步纯化。或根据蛋白的等电点，利用 HP/Q 柱进行纯化，最后可以通过蛋白的分子量大小利用 SEC 柱进行蛋白分子量区分。

4. 在冲洗过程中柱子进空气了

将柱子倒挂在泵头上，使用较快流速冲洗结合缓冲液或 ddH₂O 10~20 个柱体积，将气体全部排空。