🔥 hoechst 染色（悬浮细胞）

Hoechst 是一种可以穿透细胞膜的膜通透性荧光染料，在嵌入双链 DNA 后释放蓝色荧光，故正常细胞和中早期凋亡细胞均可被 Hoechst 着色，正常细胞核 Hoechst 染色的形态呈圆形，淡蓝色，内有较深的蓝色颗粒，而凋亡细胞的细胞核由于浓集而呈亮蓝色，或核呈分叶，碎片状。

Hoechst 33258 常用于细胞凋亡检测，多用干活细胞染色，染色后用荧光显微镜观察或流式细胞仪检测。

Hoechst 33342 活细胞和死细胞均可。Hoechst 33342 能透过胞膜完整的细胞嵌入细胞核 DNA 使之发出明亮的蓝色荧光。

凋亡的细胞核染色增强，荧光更为明亮，呈圆状或固缩状、团块状结构。非凋亡细胞核呈现荧光深浅不一的结构样特征。二者形态迥然相异，很易区别判别。

Hoechst 33258 和 Hoechst 33342 均为非嵌人性荧光染料。它们在活细胞中 DNA 聚 AT 序列富集区域的小沟处与 DNA 结合。活细胞或固定细胞均可从低浓度溶液中摄取该染料。从而使细胞核着色。故又把此类染料称为 DNA 探针。

Hoechst 33342 和 Hoechst 33258 均可溶于水并在水溶液中保持稳定。Hoechsr-DNA 的激发和发射波长分别 550 nm 和 460 nm。在荧光显微镜紫外光激发时，Hoechst-DNA 发出亮蓝色荧光。

观察细胞形态和细胞的凋亡鉴定。

普通洁净盖玻片、无菌超净台、4% 多聚甲醛、PBS、细胞培养液、盖玻片、细胞固定液、Hoechst 染色液、显微镜、离心管、离心机、抗荧光淬灭封片液。

（1）离心收集细胞样品于 1.5 ml 离心管内，加入 0.5 ml 4% 多聚甲醛固定液，缓缓悬起细胞，固定 10 分钟或更长时间（可 4 ℃ 过夜）。

（2）离心去固定液，用 PBS 洗三遍，每次 3 分钟。

（3）最后一次离心后吸去大部分液体保留约 50 ml 液体，再缓缓悬起细胞，滴加至载玻片上，尽量使细胞分布均匀。

（4）晾干后，使细胞贴在载玻片上不易随液体流动。

（5）均匀滴上 0.5 ml Hoechst 染色液，染色 5 分钟，用吸水纸从边缘吸去液体，晾干。

（6）用 PBS 洗三遍，每次 3 分钟。

（7）滴一滴抗荧光淬灭封片液于载玻片上，盖上一洁净的盖玻片，尽量避免气泡。

（8）荧光显微镜可检测到呈蓝色的细胞。

1、过程需要无菌；

2、盖玻片时小心，不能产生气泡或者正反颠倒；

3、洗涤期间手动晃动；

4、为减缓荧光淬灭可以使用抗荧光淬灭封片液，建议染色后尽量当天完成检测；

5、对于悬浮细胞，至少加入待染色样品体积 3 倍的染色液，并混匀，室温放置 3～5 分钟；

6、Hoechst 33342 对细胞的毒性作用更小一些，因此一般 Hoechst 33258 用于细胞固定后再染色，而 Hoechst 33342 则可以对活细胞直接进行染色。