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🔥 hoechst 染色(悬浮细胞)

相关实验:🔥 Hoechst 染色实验

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合作专家 | 郭新容硕士

临床医学 中南大学

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审核专家 | 聂壹峰博士

纳米生物医学 中国科学院大学

简介

Hoechst 是一种可以穿透细胞膜的膜通透性荧光染料,在嵌入双链 DNA 后释放蓝色荧光,故正常细胞和中早期凋亡细胞均可被 Hoechst 着色,正常细胞核 Hoechst 染色的形态呈圆形,淡蓝色,内有较深的蓝色颗粒,而凋亡细胞的细胞核由于浓集而呈亮蓝色,或核呈分叶,碎片状。

Hoechst 33258 常用于细胞凋亡检测,多用干活细胞染色,染色后用荧光显微镜观察或流式细胞仪检测。

Hoechst 33342 活细胞和死细胞均可。Hoechst 33342 能透过胞膜完整的细胞嵌入细胞核 DNA 使之发出明亮的蓝色荧光。

凋亡的细胞核染色增强,荧光更为明亮,呈圆状或固缩状、团块状结构。非凋亡细胞核呈现荧光深浅不一的结构样特征。二者形态迥然相异,很易区别判别。

原理

Hoechst 33258 和 Hoechst 33342 均为非嵌人性荧光染料。它们在活细胞中 DNA 聚 AT 序列富集区域的小沟处与 DNA 结合。活细胞或固定细胞均可从低浓度溶液中摄取该染料。从而使细胞核着色。故又把此类染料称为 DNA 探针。

Hoechst 33342 和 Hoechst 33258 均可溶于水并在水溶液中保持稳定。Hoechsr-DNA 的激发和发射波长分别 550 nm 和 460 nm。在荧光显微镜紫外光激发时,Hoechst-DNA 发出亮蓝色荧光。

用途

观察细胞形态和细胞的凋亡鉴定。

材料与仪器

普通洁净盖玻片、无菌超净台、4% 多聚甲醛、PBS、细胞培养液、盖玻片、细胞固定液、Hoechst 染色液、显微镜、离心管、离心机、抗荧光淬灭封片液。

步骤

(1)离心收集细胞样品于 1.5 ml 离心管内,加入 0.5 ml 4% 多聚甲醛固定液,缓缓悬起细胞,固定 10 分钟或更长时间(可 4 ℃ 过夜)。

(2)离心去固定液,用 PBS 洗三遍,每次 3 分钟。

(3)最后一次离心后吸去大部分液体保留约 50 ml 液体,再缓缓悬起细胞,滴加至载玻片上,尽量使细胞分布均匀。

(4)晾干后,使细胞贴在载玻片上不易随液体流动。

(5)均匀滴上 0.5 ml Hoechst 染色液,染色 5 分钟,用吸水纸从边缘吸去液体,晾干。

(6)用 PBS 洗三遍,每次 3 分钟。

(7)滴一滴抗荧光淬灭封片液于载玻片上,盖上一洁净的盖玻片,尽量避免气泡。

(8)荧光显微镜可检测到呈蓝色的细胞。

注意事项

1、过程需要无菌;

2、盖玻片时小心,不能产生气泡或者正反颠倒;

3、洗涤期间手动晃动;

4、为减缓荧光淬灭可以使用抗荧光淬灭封片液,建议染色后尽量当天完成检测;

5、对于悬浮细胞,至少加入待染色样品体积 3 倍的染色液,并混匀,室温放置 3~5 分钟;

6、Hoechst 33342 对细胞的毒性作用更小一些,因此一般 Hoechst 33258 用于细胞固定后再染色,而 Hoechst 33342 则可以对活细胞直接进行染色。

来源:丁香实验

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