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病毒 的分离和鉴定

相关实验:皮肤和黏膜感染病毒及其检验

最新修订时间:

简介

不同的病毒分离时采用不同的分离方法,这主要取决于目的病毒的生物学特性。常用的病毒分离方法有细胞培养法、鸡胚接种法、动物接种法,而对细胞、鸡胚不敏感,又没有合适动物模型的病毒,可采用基因克隆的方法。

材料与仪器

器材:
①一次性无菌手套
②标本采集管
③棉签拭子
④电子显微镜
⑤微孔板条
⑥酶标仪
⑦PCR仪


试剂:
①材料:待采标本
②PBS缓冲液
③琼脂

步骤

病毒分离和鉴定根据病毒种类不同,其基本步骤可分为如下几种:


(一)痘病毒


1.用12日龄鸡胚做致死试验来鉴别天花病毒的不同型别。将痘苗病毒鼻内接种给乳鼠可导致致死性肺炎,有些痘苗病毒株皮内注射可引起2日龄的家兔死亡,故可用乳鼠和乳兔鉴别不同毒株,也可以测定用于生产疫苗的痘种毒力。兔和小鼠是猴痘病毒的易感实验动物。


2.鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)法可用于正痘病毒的分离,副痘病毒和雅塔病毒不能用鸡胚绒毛尿囊膜法分离。


(1)分离天花和猴痘病毒时,将待分离标本(血液、唾液、涂片、水疱液、脓疱液和痂皮)制成悬液,接种于受精鸡胚(38~39 ℃孵育11~13天)绒毛尿囊膜上。


(2)将接种后的鸡胚置35 ℃,孵育72小时。


(3)在培养过程的观察中,记录鸡胚上脓疱出现的时间、形态、大小以及病灶颜色。此法可鉴别天花和猴痘病毒。天花病毒在CAM上形成直径为1 mm光滑圆盖状的痘斑,颜色呈灰白色或乳白色,无出血。放大10倍观察有一晕圈绕在不透明的中心周围,呈煎荷包蛋状;猴痘病毒在CAM上形成的痘斑直径1 mm左右,痘斑呈扁平而周围隆起,有些痘斑中心似火山口,有些痘斑出血,红细胞聚集在中心区。


3.细胞培养:多数人和灵长类动物细胞均可用于天花、猴痘等正痘病毒的培养。常规使用人胚肺、婴儿包皮二倍体细胞、原代恒河猴肾细胞、Vero细胞等。猴痘病毒、牛痘病毒和痘苗病毒接种细胞后,1~3天内感染细胞发生融合脱落,形成直径2~6 mm的空斑。天花病毒感染的细胞1~3天内形成多核融合细胞,并有细胞增生团,脱落空斑较小,直径1~3 mm。据此,猴痘病毒、牛痘病毒和痘苗病毒可与天花鉴别。另外,在单层细胞上,天花病毒产生细胞病变(CPE)而猴痘病毒不产生CPE。


(二)疱疹病毒


1.动物试验:将HSV接种家兔角膜,很容易引起家兔的角膜炎,并在家兔体内建立病毒的三叉神经节的潜伏感染,因此家兔是最常用的HSV角膜炎模型。另外也常用豚鼠作为HSV的生殖器感染模型。


2.细胞培养


(1)敏感细胞:多种动物细胞对疱疹病毒易感,可用于进行培养分离。原代兔肾、豚鼠胚成纤维细胞、人胚细胞(肾或肺)对单纯疱疹病毒最敏感,人肺二倍体MRC-5和WI-38细胞株对病毒也相当敏感,其他如传代细胞HeLa、Hep-2、A549,猴肾传代细胞如Vero、MA104等细胞也可用于病毒的分离培养,但敏感性不如人原代细胞和二倍体成纤维细胞。

人胚肺原代成纤维细胞、WI-38、MRC-5可用于VZV的分离培养;EB病毒的体外培养比较困难,一般用血清学方法进行辅助诊断,如需培养,应将咽漱液、唾液等标本直接接种到人脐带血淋巴细胞中,培养时间为4周;HCMV对宿主或组织培养细胞有明显的种属特异性要求,只有在同种的动物成纤维细胞中才能增殖,且培养分离方法是检测巨细胞病毒的金标准,所有一切新的检测技术均需要与此方法比较,才能获得正确的评价。


(2)细胞病变:HSV引起的细胞病变(CPE)的特点是,感染细胞肿大、变圆,折光性强,有的分离株会导致细胞融合,形成多核巨细胞,CPE出现快而明显。含有高浓度病毒的标本,可在接种后18~24小时出现CPE,病毒含量低的标本则需要4~5天才能观察到CPE。

如果在细胞培养液中添加地塞米松,可加快CPE的出现或者增加CPE病灶的数量。区别单纯疱疹病毒1型和2型的方法有4种:

①HSV-1不在鸡胚成纤维细胞形成空斑,而HSV-2常在此细胞形成空斑;②HSV-1对溴乙烯尿苷(BVDU)相当敏感,而HSV-2则对BVDU相对抵抗;③型特异性单克隆抗体分型;④DNA限制性内切酶图谱分析。


与HSV相比,VZV的复制周期长、繁殖缓慢,CPE通常在接种后3~14天才出现。病毒在感染细胞中的病灶开始局限,发展十分缓慢。病灶内的病变细胞肿胀变圆,出现核内嗜酸性包涵体,形成多核巨细胞。病毒可通过细胞与细胞间进行扩散而感染邻近细胞,细胞培养液中含有很少的感染性病毒。


HCMV在细胞培养中,CPE出现一般较慢,短者数天,长者可达数周,一般7~12天。特点是细胞膨胀,核变大,形成巨大的细胞,有折光性的细胞质颗粒和核内包涵体。病毒感染早期病毒与细胞紧密结合,病毒感染可在细胞之间传播,并逐步扩展至邻近细胞,病变细胞相互连接,形成感染灶。病灶中最先出现的病变细胞逐渐退化脱落,最后病变扩散到整个单层细胞。


(三)人乳头瘤病毒


有些情况下,病毒能够在细胞中发生流产感染。用跖疣的人乳头瘤病毒感染胎兔肾细胞或人胚肺成纤维细胞,可短暂刺激病毒DNA合成,但无细胞病变产生;在感染后的人成纤维细胞里可测出低水平的病毒DNA序列。

来源:丁香实验

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