皮肤和黏膜感染标本直接检测病毒

直接检测病毒的方法包括电镜观察病毒颗粒、光镜下观察病毒感染后宿主细胞的特殊改变、免疫荧光检测、酶免疫技术以及病毒核酸检测技术等。

器材：
①一次性无菌手套
②标本采集管
③棉签拭子
④电子显微镜
⑤微孔板条
⑥酶标仪
⑦PCR仪

试剂：
①材料：待采标本
②PBS缓冲液
③琼脂

皮肤和黏膜感染病毒标本直接检测病毒的基本步骤可分为如下几种：

（一）直接检测病毒颗粒

1．痘病毒，电镜检查是诊断所有痘病毒感染的最可靠、最快速的方法。用磷酸盐缓冲液（PBS）将采集的水疱或脓疱制成悬液，痂皮或活检组织用PBS研磨制成悬液，滴于载网上，经负染后用电镜观察。

电镜观察不能区别天花、猴痘、痘苗和牛痘病毒，但能够鉴别水痘-带状疱疹病毒与痘病毒（天花或猴痘）感染。患者病损基底部涂片的吉姆萨染色法，在光学显微镜下可对天花病毒进行快速诊断。在活动期病损部位有大量的病毒，可作出准确的诊断，但出疹以前的潜伏期几乎不能检出天花病毒。

2．疱疹病毒，取疱疹液直接进行电子显微镜负染色检测可迅速确诊疱疹病毒感染，电子显微镜下的HSV颗粒多有包膜，病毒形态比较典型。

（二）直接检测病毒抗原

1．天花病毒 用琼脂凝胶沉淀试验、补体结合试验、免疫荧光试验可检测天花病毒抗原。与电镜相比，这些检测技术的结果常不可靠，偶用酶联免疫吸附试验和放射免疫试验，但不列为常规。

2．疱疹病毒

（1）单纯疱疹病毒：

如有宫颈脱落细胞、角膜细胞、脑活检组织或皮肤黏膜病损灶，可用于病毒抗原检测，常用的方法有免疫荧光法或免疫酶法。第一抗体为特异性的HSV多克隆抗体或型特异性的单克隆抗体，如使用单克隆抗体，固定组织或细胞的最好为乙醇或甲醇，而不宜使用丙酮。

（2）水痘-带状疱疹病毒：

由于临床表现典型，一般不做实验室检测，对不典型的或临床特殊病例需做病原学诊断的，可取疱疹病损部位的涂片、皮肤刮取物、水疱液、活检组织等采用免疫组化、免疫荧光法、免疫酶法进行检测。痂皮和疱疹拭子、活检组织可用于检测VZV特异性抗原（如gE蛋白、ICP4等）和核酸。

（3）人巨细胞病毒：由于HCMV在细胞培养中出现CPE时间较长，因此，近年来用抗人巨细胞病毒早期抗原的单克隆抗体，通过间接免疫荧光和免疫酶技术检测接种临床标本（白细胞、活检组织、组织切片、支气管肺泡洗液等）的组织细胞培养物中的病毒早期抗原，其中包括IEA、EA、LA和pp65等。

与常规细胞培养相比，敏感性达93％ ，特异性达94.4％ ，可在接种标本后24小时内检出病毒。应用免疫组化法可检测病变组织中病毒抗原，也是分析各种器官中HCMV播散的有用工具，本法也可用于病毒抗原血症的定量检测。

其定量测定法是指10个外周血多形核白细胞中IEA、EA阳性细胞数，并将＜10、10～50、＞50个IEA、EA阳性细胞数定为低、中、高抗原血症水平。本法亦可用于免疫缺陷病患者的HCMV感染的早期快速诊断，并可作为监视疾病活动性和指导临床治疗及观察疗效的指标。

（4）EB病毒：在大多数相关病变组织中有存在病毒的核蛋白和膜蛋白，可用免疫荧光法检测。

（三）直接检测病毒抗体

病毒抗体检测是检测疱疹病毒感染，特别是对确定某些原发、急性或活动性病毒感染，筛选血、器官供体，均需做血清学检测。

1．单纯疱疹病毒 目前诊断HSV感染的免疫学方法有补体结合试验（CF）、中和试验（NT）、免疫荧光试验（IFA）、ELISA和放射免疫试验（RIA）等。临床常用ELISA法检测抗HSV-IgM类抗体，并有商品试剂盒供应。

以ELISA检测抗HSV-IgM类抗体为例介绍：

①在孔架中放入合适数量微孔板条。
②血清标本，阳性、阴性对照和校正液用标本稀释液作1：40稀释，混匀后分别加至微孔中，100 μl／孔，以稀释液做空白，室温30分钟。
③弃孔内液体，用洗涤液洗3次。每孔加入100 μl酶标记抗体液，室温30分钟。用洗涤液洗涤3次。
④每孔加入100 ul TMB-H₂O₂液，室温30分钟呈色。
⑤每孔加入100 μl 12 mol／L HCl溶液终止反应，酶标仪450 nm波长读吸光度（A）值。

2．人巨细胞病毒 HCMV血清学检测的特异性抗体有IgG和IgM等，可取患者双份血清检测IgG抗体，抗体效价或滴度如有4倍或以上增长可临床诊断；取单份血清检测IgM抗体，如阳性说明患者近期感染HCMV或发生活动性HCMV感染；近年来国内外也有检测人巨细胞病毒IgA抗体作为诊断活动性人巨细胞病毒感染的指标。同时检测人巨细胞病毒IgM和IgA，其阳性率明显高于单纯检测人巨细胞病毒IgM。

由于检测HCMV IgM可受类风湿因子与IgG竞争抗原的干扰，在检测标本时应对血清预处理以去除IgG抗体，避免血清反复冻融，才能提高IgM的检测率。

3．EB病毒 在增殖性感染过程中产生多种抗原，如病毒早期抗原（VEA）、病毒衣壳抗原（VCA）、病毒核抗原（VNA）、病毒膜抗原（VMA）等，并诱导产生多种针对不同抗原的抗体，各种抗体出现的时间和意义有所不同。

VCA-IgG抗体在病毒感染早期即存在，并长期存在，而效价的动态改变不明显，一般用于流行病学调查；VCA-IgM抗体出现，随之出现的抗NA抗体效价的逐步增高提示原发性感染；VCA-IgA或EA-IgA抗体滴度≥1：5～1：10或滴度持续升高，对鼻咽癌有辅助诊断意义。许多鼻咽癌患者发病鼻咽黏膜恶变早期即可测出上述抗体，经治疗好转后上述抗体的效价也逐渐降低。

（四）直接检测病毒核酸

1．疱疹病毒检测 单纯疱疹病毒DNA可用PCR或原位核酸杂交法，对病毒感染进行早期、快速诊断，不仅可使检测时间大大缩短，为临床治疗提供了有利时机，而且其敏感性和特异性非常高。

原位杂交检测核酸技术不仅可以直接检测出甲醛固定的石蜡包埋组织切片中的疱疹病毒，并可用于多种患者活动性疱疹病毒感染的诊断。目前采用PCR技术可快速诊断疱疹病损组织或其他多种组织中的病毒DNA，如快速检测病毒性脑炎患者脑脊液中的HSV DNA，检测先天性HCMV感染或免疫抑制患者活动性HCMV感染以及鼻咽癌组织中的EB病毒DNA等。

其阳性检出率明显高于细胞培养法。但一般PCR法都是定性诊断，其检出不一定与病毒血症和临床症状相一致，近年来使用的定量PCR，可定量检测出疱疹病毒的实际水平，与病毒血症和临床症状相一致，且病毒DNA血症出现时间比病毒血症、抗原血症出现时间更早，为进一步监测病毒活动性感染和判断病毒治疗疗效提供了可靠依据。

常用的检测HSV-1或HSV-2型糖蛋白基因gB的特异性引物如下：5＇引物：5＇-GCATCGTCGAGGAGGTGGAC-3＇；3＇引物：5＇-TTGAAGCGGTCGGCGGCGTA-3＇。该引物不能 扩增VZV、HCMV DNA，其PCR产物大小为149bp。

产物的特异性鉴定可用Southern印迹法，杂交用gB探针序列为5＇-GGCGACTTTGTGTACATGTCCCCGTTTTACGCGTACCGG-3＇。限制 性内切酶Bstl消化PCR产物可区分 HSV-1（有切点85＋64bp）与HSV-2（无切点）。

2．人乳头瘤病毒 由于目前尚未建立可靠的血清学方法，检测病毒DNA是用于诊断人乳头瘤病毒的主要方法，可以用核酸杂交或PCR的方法。

（1）核酸杂交：人乳头瘤病毒分型及感染诊断采用DNA-DNA分子杂交法。从怀疑为人乳头瘤病毒感染的病变组织中提取DNA，与标记的人乳头瘤病毒DNA探针进行斑点杂交、Southern印迹或原位杂交。该法敏感，如探针为型特异性，即可检测出相应的人乳头瘤病毒型别。点杂交简便、易行；Southern印迹可靠，易于分型；原位杂交可以在细胞内定位。

（2）PCR：PCR技术用于人乳头瘤病毒感染诊断，具有方便、快速、特异、敏感的特点，极有应用价值。可根据不同病毒型别的特异保守区，分别设计各个型别的引物，进行PCR扩增，直接确定不同型别的人乳头瘤病毒感染。

也可根据病毒所有型别的共同保守区设计通用型引物，将这一对引物经PCR扩增后，就可检出所有型别的人乳头瘤病毒感染。如果需要分型，再将阳性病例用型特异性的引物作PCR，或用型特异性的寡核苷酸探针作点杂交或Southern印迹，以确定感染的型别。