简介
(1) 质粒抽提及定量：大量扩增宿主菌 E.coli DH5α，用质粒抽提试剂盒提取足量质粒 DNA，经紫外分光光度计纯度鉴定及定量后，用磷酸盐缓冲液调整为 100 μg/200 ul。
(2) 基因免疫：免疫前 5 天行预处理，在小鼠胫前肌分 3 点注射 PBS 液 100 μl，然后在小鼠胫前肌相应部位分别注射 100 μg 重组质粒 pcDNA311/hTSHR，免疫后第 3、6 周加强免疫两次。18 周后处死所有小鼠。
(3) 分离牌细胞：基因免疫后 18 周，所有小鼠分别用颈椎脱臼法处死，75% 乙醇消毒皮毛。无菌取出脾脏，用 RPMI 1640 液冲洗，摘除脂肪及其他结缔组织。将脾脏剪碎、匀浆、过滤，制成脾细胞悬液，调整细胞浓度为 106/100 ul。
(4) 脾细胞转移：在小鼠尾静脉注人活化脾细胞，脾细胞注射量均为 106。4 周后处死所有小鼠。
观察指标：摘取甲状腺和眼眶组织进行病理学组织检查，甲状腺和眼眶组织分别采用冷冻以及石蜡切片，并检测相关指标。所有采出的血液用 ELISA 法检测血清指标检测。
原理
在前述模型的基础上，从脾脏取出活化的免疫细胞，再次进行免疫注射造模，其免疫特征呈放大效应。
用途
由于该模型涉及了体液和细胞免疫，因此在免疫机制研究中有明显优势。
材料与仪器
实验动物：
采用 6～8 周龄的雌性 BALB/c 小鼠。
实验仪器：
① 质粒抽提试剂盒；
② 总甲状腺素（totalltraiodohyronine, TT4）放射免疫试剂盒；
③ 促甲状腺激素（thyroid stimulating hormone, TSH）免疫放射试剂盒；
④ 促甲状腺激素受体抗体（TSH receptor antibody, TRAb）酶联免疫吸附法试剂盒。
实验试剂：
① 质粒 pcDNA311；
② 重组质粒 peDNA311/hTSHR；
③ DH5α 宿主菌；
④ 淋巴细胞分离液。
步骤
TSHR 活化的脾细胞免疫建立 Graves 眼病的动物模型的基本过程可分为如下几步：
A. 质粒抽提及定量：
大量扩增宿主菌 E.coli DH5α，用质粒抽提试剂盒提取足量质粒 DNA，经紫外分光光度计纯度鉴定及定量后，用磷酸盐缓冲液调整为 100 μg/200 ul。
B. 基因免疫：
免疫前 5 天行预处理，在小鼠胫前肌分 3 点注射 PBS 液 100 μl，然后在小鼠胫前肌相应部位分别注射 100 μg 重组质粒 pcDNA311/hTSHR，免疫后第 3、6 周加强免疫两次。18 周后处死所有小鼠。
C. 分离牌细胞：
基因免疫后 18 周，所有小鼠分别用颈椎脱臼法处死，75% 乙醇消毒皮毛。无菌取出脾脏，用 RPMI 1640 液冲洗，摘除脂肪及其他结缔组织。将脾脏剪碎、匀浆、过滤，制成脾细胞悬液，调整细胞浓度为 106/100 ul。
D. 脾细胞转移：
在小鼠尾静脉注人活化脾细胞，脾细胞注射量均为 106。4 周后处死所有小鼠。
观察指标：
摘取甲状腺和眼眶组织进行病理学组织检查，甲状腺和眼眶组织分别采用冷冻以及石蜡切片，并检测相关指标。所有采出的血液用 ELISA 法检测血清指标检测。
注意事项
该模型最大限度地模拟了人 TAO 的病理机制。甲状腺相关眼病的免疫应答过程包括细胞免疫和体液免疫，以前普遍认为其为抗体介导的免疫应答反应，免疫反应类型以 Th2 型反应为主。
但随着动物模型研究的深入，人们开始质疑这种说法。首先，人们发现不同遗传背景的鼠种会出现不同类型的免疫反应。用不同细胞作为抗原呈递细胞反应类型也不同，用成纤维细胞诱导动物模型时就以 Th2 型反应为主，而以脾细胞诱导时则以 Th1 型反应为主。
来源：丁香实验
