TSHR 基因转染的腺病毒免疫建立 Graves 眼病的动物模型

最新修订时间：2022-02-10

简介

(1) 利用含 TSHR 的 A 亚单位的穿梭质粒构建腺病毒表达的 TSHR 的 A 亚单位。穿梭质粒 pHMCMVTSHR289 用常规 CaCl2 法转化 DH5ax 大肠埃希菌感受态细胞。

(2) 重组质粒 pAdHM4CMVTSHR 构建：

穿梭质粒 pHMCMVTSHR 和骨架质粒 pAdHM4 均由酶 I-Ceu/PI-Sce 双酶切后，转入 E.coli BJ5183 中, 使两者在其中重组。挑选、抽提质粒，得到腺病毒重组质粒 pAdHM4CMVTSHR289，用酶切鉴定。

(3) 重组腺病毒的包装、扩增及纯化：

腺病毒重组质粒 pAdHM4CMVTSHR289 经 Pac I 酶切后, 用凝胶回收试剂盒纯化线性化 pAdHM4CMVTSHR289。准备 293E 细胞，行感染扩增重组病毒，并行鉴定。

(4) 甲状腺相关眼病动物模型的构建：

实验动物采用同系 6-8 周大小雌性 BALB/c 小鼠，将 undefined10^II AdCMVTSHR289 抗原颗粒溶于 50 μl 的 PBS 液中，分别于 0、3、6、9 周行 BALB/c 小鼠胫前肌内注射，所有小鼠在免疫前及每一次免疫后 2 周从尾静脉采血。

观察指标：

16 周时处死 BALB/c 小鼠，从心脏取血，同时摘取甲状腺和眼眶组织进行病理学组织检查，甲状腺和眼眶组织分别采用冷冻以及石蜡切片，并检测相关指标。所有采出的血液用 ELISA 法检测血清指标检测。

原理

以腺病毒为载体，将 TSHR 基因转染到小鼠体内，造成自身免疫反应，导致眼眶和甲状腺病变。

用途

在所有的模型中，采用含有 TSHR 基因的质粒转染的腺病毒免疫鼠的成模率最高，应用最为广泛。

材料与仪器

实验器材：

小量抽提试剂盒与凝胶回收试剂盒。

实验试剂：

① 含 TSHR 的 A 亚单位的穿梭质粒 pHMCMVTSHR289；

② 骨架质粒 pAdHM4；

③ 293 E 细胞；

④ DH5α 感受态细菌；

⑤ coli BJ5183 电感受态菌；

⑥ 酶 I-Ceu，PI-Sce I，Pac I。

步骤

TSHR 基因转染的腺病毒免疫建立 Graves 眼病的动物模型的基本过程可分为如下几步：

A. 利用含 TSHR 的 A 亚单位的穿梭质粒构建腺病毒表达的 TSHR 的 A 亚单位。穿梭质粒 pHMCMVTSHR289 用常规 CaCl2 法转化 DH5ax 大肠埃希菌感受态细胞。

B. 重组质粒 pAdHM4CMVTSHR 构建：

穿梭质粒 pHMCMVTSHR 和骨架质粒 pAdHM4 均由酶 I-Ceu/PI-Sce 双酶切后，转入 E.coli BJ5183 中，使两者在其中重组。挑选、抽提质粒，得到腺病毒重组质粒 pAdHM4 CMVTSHR289，用酶切鉴定。

C. 重组腺病毒的包装、扩增及纯化：

腺病毒重组质粒 pAdHM4CMVTSHR289 经 Pac I 酶切后，用凝胶回收试剂盒纯化线性化 pAdHM4CMVTSHR289。准备 293E 细胞，行感染扩增重组病毒，并行鉴定。

D. 甲状腺相关眼病动物模型的构建：

观察指标：

注意事项

雌性动物发病率比雄性动物明显高，与人类 TAO 类似；模型的眼眶病理改变和人类似，同时也可以检测出激素水平及自身抗体的抗体。

来源：丁香实验