神经干细胞的制备

别名：UCMSCs

最新修订时间：2022-02-10

简介

神经干细胞的研究是目前神经科学和其他相关学科研究的热点之一。现已证实在皮质、室管膜下层、纹状体、海马、中脑等区域都存在神经干细胞。神经干细胞可被生长因子诱导而增殖并保持分化成神经元及胶质细胞的潜能，移植后能在宿主的神经组织中良好地生存、整合及分化，神经干细胞的发现、研究和应用，将在神经系统发育、神经损伤的修复、神经退行性疾病、神经组织移植和脑肿瘤的基因治疗等多方面起到重要的作用。

材料与仪器

器材：

① 2 把尖解剖剪：长 10 cm，两个 Perry 镊：长 12.5 cm；注射器

② 200 目筛网

③ 100 mm 培养皿、15 ml 离心管

④ 离心机、培养箱

⑤ 7 号针头、4 号半针头

试剂：

① 出生一周龄内的小鼠

② NSCmedium 97% DMEM/F12 + 1% B27 + 1% BSA + 1% Streptomycine-Penicillin + 20 ng/ml bFGF + 20 ng/ml EGF

③ PBS(1000 ml) 0.57 g Na2 HPO₄ + 8 g NaCl + 0.25 g KCl + 0.25 g KH₂PO₄

④ 10% DMEM 87% DMEM/F12 + 10% FBS + 1% L-glutamine+1% NEAA + Streptomycine-Penicillin

PBS（1000 ml）:0.57 g Na，HPO₄ ＋ 8 g NaCl ＋ 0.25 g KCl ＋ 0.25 g KH₂PO₂

步骤

神经干细胞的制备的基本过程可分为如下几步：

1. 采取颈椎脱臼法处死小鼠，将鼠体浸泡于 750 ml/L 乙醇中 3～5 分钟。

2. 取一套原代器械包尽量在无菌条件下取出打开颅骨，剥离脑膜。

3. 取 1 个 35 mm 皿置于冰上，皿中加 2 ml PBS，将取出脑区放入皿中。

4. 将 35 mm 皿置于超净工作台中，再取一套原代器械包置于超净工作台中。

5. 取 3 个 35 mm 培养皿加入 2 ml 含 2% SP 的 PBS，将脑反复清洗 3 遍，去除杂质，置于一个新皿中。

6. 将脑组织剪 5～6 分钟，碎成糜状加 10 ml 的 0.05% 胰酶消化，利用剪掉一个小口的枪头转移到 50 ml 离心管中 37 ℃ 消化。

7. 每隔 5 分钟振荡一次共消化 20 分钟，最后 5～6 分钟时加入 DNA 酶共同消化。

8. 加入 15 ml 10% DMEM 终止消化，轻轻混匀（不宜吹打），待组织沉淀后小心弃去上清。

9. 再加 3 ml 10% DMEM 充分吹打沉淀，至所有组织块被充分吹散后。

10. 静置 8～10 分钟，使之充分沉淀，小心吸取上清过 200 目筛网，移入 15 ml 离心管中，1000 r/min 离心 5 分钟。

11. 弃上清，加入 NSC expansion medium 重悬，接种于培养皿中培养。

12. 培养神经干细胞因为其快速分裂，故处于悬浮状态，杂细胞则贴壁生长，取培养液传代培养，进一步纯化。

来源：丁香实验