脂肪干细胞的制备

别名：ASCs

最新修订时间：2022-02-10

简介

ASCs 是一种脂肪组织来源的间充质干细胞，具有干细胞的共性，即自我更新及多向分化的能力，可取自自体，遗传背景稳定，可在体外培养、扩增及诱导。原代 ASCs 经过 2～4 天的潜伏期后，迅速集落性扩增，细胞与 MSCs 类似呈均一的梭形的成纤维状形态，倍增时间为 33～38 小时。基因和超微结构表明 ASCs 也具有强大的分化可逆性。

材料与仪器

器材：

① 2 把尖解剖剪：长 10 cm，两个 Perry 镊：长 12.5 cm；注射器

② 200 目筛网

③ 100 mm 培养皿、15 ml 离心管

④ 离心机、培养箱

⑤ 7 号针头、4 号半针头

试剂：

① 材料：6～8 周龄雄性 Sprague-awley 大鼠

② ASC medium：82% α-MEM ＋ 15% FBS ＋ 1% NEAA ＋ 1% L-Glutamine ＋ 1% Streptomycine-Penicillin ＋ 4 ng/ml BFGF

③ PBS（1000 ml）：0.57 g Na, HPO4 ＋ 8 g NaCl ＋ 0.25 g KCl ＋ 0.25 g KH2PO2

④ 0.1% I 型胶原酶

步骤

脂肪干细胞的制备的基本过程可分为如下几步：

1. 采取颈椎脱日法处死小鼠，将鼠体浸泡于 750 ml/L 乙醇中 3～5 分钟。

2. 尽量在无菌条件下切除附睾脂肪垫。

① 用一把解剖剪剪开腹部皮肤，暴露腹膜；

② 用另一把解剖剪剖开腹膜，然后用 Perry 镊向上牵拉睾丸；

③ 剪取附睾脂肪垫，注意保留血管。

3. 将组织移入超净工作台中 35 mm 培养皿中，再取一套原代器械包置于超净工作台中。

4. 取 3 个 35 mm 培养皿，每个加入 3 ml 含 2% SP 的 PBS，清洗脂肪组织 3 遍，直到表面干净无血色，置于新培养皿中。

5. 将 4 g 脂肪组织用解剖剪反复剪碎成大约 1 mm3 细小组织块，加入少量 0. 1% I 型胶原酶移入 15 ml 离心管。

6. 将胶原酶溶液补至 2 ml，37 ℃ 恒温摇床振荡消化 30 分钟。

7. 反复振荡吹打，直至细胞混合物形成乳脂样浓稠液体，加入 4 ml ASC medium。

8. 200 目筛网过滤，移入一个新的 15 ml 离心管中，1000 r/min 离心 8 分钟，沉降细胞。

9. 使用真空吸液器吸去上清液及悬浮脂肪组织。

10. 加入培养液重悬细胞并调整细胞密度。

11. 以合适的密度接种于培养瓶中，标记为原代细胞（P。）。

12. 置 37 ℃、5% CO₂、饱和湿度的培养箱中静置培养。

13. 于 24 小时后首次更换培养液，去除未黏附细胞，以后每 3 天更换 1 次培养液。

14. 待细胞长至 80%～90% 融合时传代。

来源：丁香实验