密度梯度离心法制备骨髓间充质干细胞

最新修订时间：2022-02-10

简介

骨髓间充质干细胞（BMSCs）广泛存在于结缔组织和器官间质中，以骨髓组织中含量最为丰富，由于骨髓是其主要来源，因此统称为骨髓间充质干细胞。

目前体外用于分离纯化 BMSCs 的方法主要有 5 种：

① 利用 BMSCs 与培养底物的黏附性采用的全骨髓贴壁筛选法；

② 根据 BMSCs 低密度特性采用的密度梯度离心法；

③ 根据 BMSCs 的细胞表面标志，采用相应的荧光素标记抗体进行染色的流式细胞仪分选法；

④ 根据 BMSCs 表面抗原能与连接有磁珠的特异性单抗相结合而采用的免疫磁珠分选法；

⑤ 利用一种独特的培养装置从骨髓中筛选 BMSCs 的特制培养板筛选法。Percoll 密度梯度离心法虽被认为是最经典的方法，其所得细胞纯度高、分化能力好，但增殖能力较差。

材料与仪器

器材：

① 2 把尖解剖剪：长 10 cm，两个 Perry 镊：长 12.5 cm；注射器

② 200 目筛网；

③ 100 mm 培养皿、15 ml 离心管

④ 离心机、培养箱

⑤ 7 号针头、4 号半针头

试剂：

① 材料：6～8 周龄雄性 Sprague-awley 大鼠

② 促性腺激素

③ PBS、EDTA 溶液、乙醇

④ MSC medium：82% α-MEM ＋ 15% FBS＋1% NEAA ＋ 1% L-Glutamine ＋ 1% Streptomycine-Penicillin + 1 ng/ml BFGF

步骤

密度梯度离心法制备骨髓间充质干细胞的基本过程可分为如下几步：

1．采取颈椎脱臼法处死小鼠，将鼠体浸泡于 750 ml/L 乙醇中 3～5 分钟。

2．取一套原代器械包，尽量在无菌条件下取出完整股骨，清除围围附着组织。

3．将股骨置于超净工作台中 100 mm 培养皿中，再取一套原代器械包置于超净工作台中。

4．用解剖剪剪掉股骨一侧骨骺部分，用吸有培养液的注射器（7 号针头）冲出骨髓。

5．用含 15% 胎牛血清（FBS）的 MSC medium 适当稀释，离心去脂肪层。

6．加入 5 ml 含 15% 胎牛血清的 MSC medium，制成细胞悬液。

7．用比重 1. 073 的 Percoll 分离液分离，800 r/min 离心 20 分钟。

8．可见中间有一层 1～2 mm 厚的白色层，仔细用吸管吸取界面层。

9．加入 PBS3 ml 离心洗涤，离心去 PBS。

10．加入培养液重悬细胞并调整细胞密度。

（1）以合适的密度接种于培养瓶中，标记为原代细胞（Po）。

（2）置 37 ℃、5% CO₂、饱和湿度的培养箱中静置培养。

（3）于 72 小时后首次更换培养液，去除未黏附细胞，以后每 3 天更换 1 次培养液。

（4）待细胞长至 80%～90% 融合时传代。

来源：丁香实验