间接法检测抗体

器材：

微量加样器、高结合力酶标反应板、酶标仪等。

试剂：

①0.05 mol／L碳酸盐缓冲液，pH9.5（Na₂CO₃1.59 g＋NaHCO₃ 2.93 g溶于双蒸水至1000 ml）。

② 0.01 mol／L磷酸盐缓冲液（PBS），pH7.4。

③封闭液（5％ 脱脂乳-PBS，pH7.4）。

④洗涤液（0.05％ Tween20-PBS，pH7.2）。

⑤样本稀释液（0.05％ Tween20-1％ BSA-PBS溶液，pH7.4）。

⑥辣根过氧化物酶（HRP）标记抗体。

⑦OPD溶液：①磷酸盐-柠檬酸缓冲液：pH5.0（柠檬酸7.3 g＋Na₂HPO₄•2H₂O 11.86 g溶于双 蒸水至1000 ml）；②OPD底物溶液：10 mg OPD加入25 ml磷酸盐-柠檬酸缓冲液中，完全溶解后，于用前加入5 μl30％ H₂O₂（V／V）。

注意：OPD溶液不稳定，应避光保存；OPD有致癌性报道，操作时须戴手套。

⑧TMB 溶液：将2.5 mg TMB溶于250 μl DMSO后加磷酸盐-柠檬酸缓冲液，pH6.0至25 ml，使用前加入5 μl30％ H₂O₂（V／V）。

TMB无致癌性报道，有商品化TMB显色液销售。

⑨终止剂（1 mol／L H₂SO₄）600 ml双蒸水中，缓慢滴加浓硫酸100 ml，并不断搅拌，双蒸水补足至900 ml。

间接法检测抗体的基本过程可分为如下几步：

A抗原被用包被液稀释抗原0.2～10 μg／ml，100 μl／孔，4 ℃过夜。

B洗板 弃去孔内溶液，拍干，加洗涤液，每孔大于250 μl，每次静置1分钟，重复3次。

C封闭 加封闭液250 μl／孔，室温，静置2小时。

D洗板 重复步骤2。

E加样 用样本稀释液稀释抗体，100 μl／孔，室温，静置2小时或4 ℃过夜。添加的样品应包括阳性血清、阴性血清、样本稀释液对照。

F洗板 重复步骤2。

G加酶标抗抗体 用样本稀释液稀释酶标抗抗体（使用前配制），100 μl／孔，室温，静置2小时。

H洗板 重复步骤2，洗板次数可增加至5次。

I加底物显色 加TMB底物溶液100 μl／孔，室温避光，静置5～15分钟。

J终止反应 加入1 mol／L H₂SO₄,50 μl／孔，振荡数秒混匀。

K结果判定 用酶标仪测定每孔在450 nm处的光吸收值

（A450 mm），以高于阴性对照平均值＋2SD为阳性判定标准。

①阳性对照：抗原＋封闭液＋阳性血清＋酶标二抗，结果应阳性。

②阴性对照：抗原＋封闭液＋阴性血清＋酶标二抗，结果应阴性。

③非特异性吸附对照组：包被液＋封闭液＋血清＋酶标二抗，结果应阴性。

④空白对照组：抗原＋封闭液＋样本稀释液＋酶标抗抗体，结果应阴性。

1．抗原包被 选择合适的酶标板和包被液以及决定包被用抗原或抗体浓度是实验良好的开端。

对于蛋白质抗原和抗体来说，一般采用pH9.6的碳酸盐缓冲液作为稀释液，也可用pH7.2的磷酸盐缓冲液。

包被浓度一般在0.5～10 μg／ml之间，可通过实验调整，如将抗原等倍稀释后包被酶标板＋梯度稀释的阳性血清＋酶标二抗，以标本稀释倍数作为X轴，相对应A值为Y轴作图，决定最佳包被抗原浓度。

2．封闭 用高浓度的无关蛋白质覆盖固相载体表面尚有未被抗原占据的空隙，从而降低后续步骤中物质（如血清标本中的Ig以及二抗）的非特异性吸附造成假阳性对检测结果的干扰。

最常用的封闭剂是0.05％～0.5％的牛血清白蛋白，1％～5％的脱脂乳，也有用10％ 的胎牛血清或1％ 明胶作为封闭剂的。还可延长封闭时间，4 ℃过夜。

并非所有的ELISA固相载体均需封闭，但在间接法测定中，封闭一般必不可少。可通过设立包被液＋封闭液＋血清＋酶标二抗对照组以判断封闭是否完全。

3．洗板 洗板的目的是去除反应液中没有与固相抗原或抗体结合的物质，以降低非特异性吸附（如间接法中血清标本内非特异性IgG吸附将与酶标抗抗体作用而产生干扰）和提高检测的特异性和敏感性。

样本稀释液和洗涤液中通常加入0.05％ Tween20，降低非特异吸附，增加洗涤效果，洗涤过程可轻微震荡，在最后一次添加底物前的洗涤，可适当增加洗涤次数到5～6次，以充分去除游离的酶标记物和非特异性吸附。

4．加样 加样时注意不要触碰孔壁和孔底，避免孔间交叉污染；应将液体加在孔底，避免黏附在孔壁，并注意不出现气泡。

5．显色 充分完全的显色反应一般需要30分钟，但多数实验可根据显色情况自行控制，以0对照孔不显色或微显色，而标准品已出现明显梯度时，即可终止反应。

OPD见光易变质，与过氧化氢混合成底物应用液后更不稳定，须使用前新鲜配制，溶液应无色透明。配制和显色过程注意避光。曾有报道OPD有致异变性，操作时应予注意。

TMB 与过氧化氢混合液较OPD稳定，TMB无致癌性报道。AKP一般采用p-NPP作为底物，可制成片剂，使用方便，产物为黄色的对硝基酚，用NaOH终止反应后，黄色可稳定一段时间。

6．比色测定 显色后用酸（HRP）或碱（AKP）终止反应，作比色测定。OPD和TMB最佳吸收波长分别为492 nm和450 nm，而p-NPP在405 nm处 有最高吸收峰。

也可选择双波长（TMB的敏感波长450 nm和非敏感波长570 nm）测定，双波长比色测定能够消除由ELISA板本身、板孔内标本的非特异吸收、指纹、刮痕、灰尘等非特异性因素对特异性光吸收值的影响。