双抗体夹心法检测抗原（酶联免疫吸附实验）

双抗体夹心法是检测可溶性抗原最常用的方法，要求待检测抗原是大分子抗原，且具备多个不同的或者相同的抗原表位，能分别被双抗体识别和结合。

常用于乙型肝炎表面抗原（HBSAg）、癌胚抗原（CEA）、细胞因子及Ig同种型检测等。

双抗体夹心法检测抗原的基本原理是将抗原特异性单克隆抗体（capture antibody）包被在固相载体表面，与受检标本中的抗原结合。

再加酶标单克隆抗体（detectionantibody），形成固相抗体-抗原-酶标抗体复合物，酶催化底物出现有色产物。结合标准品测定可对受检标本中的抗原进行定量分析。

器材：

微量加样器、高结合力酶标反应板、酶标仪等。

试剂：

①0.05 mol／L碳酸盐缓冲液，pH9.5（Na₂CO₃1.59 g＋NaHCO₃2.93 g溶于双蒸水至1000 ml）。

② 0.01 mol／L磷酸盐缓冲液（PBS），pH7.4。

③封闭液（5％ 脱脂乳-PBS，pH7.4）。

④洗涤液（0.05％ Tween20-PBS，pH7.2）。

⑤样本稀释液（0.05％ Tween20-1％ BSA-PBS溶 液，pH 7.4）。

⑥辣根过氧化物酶（HRP）标记抗体。

⑦OPD溶液：

①磷酸盐-柠檬酸缓冲液：pH5.0（柠檬酸7.3g＋Na₂HPO₄•2H₂O 11.86 g溶于双 蒸水至1000 ml）。

②OPD底物溶液：10 mg OPD加入25 ml磷酸盐-柠檬酸缓冲液中，完全溶解后，于用前加入5 μl30％ H2O2（V／V）。

注意：OPD溶液不稳定，应避光保存；OPD有致癌性报道，操作时须戴手套。

⑧TMB 溶液：将2.5 mg TMB溶于250 μl DMSO后加磷酸盐-柠檬酸缓冲液，pH6.0至25 ml，使用前加入5 μl 30％ H₂O₂（V／V）。

TMB无致癌性报道，有商品化TMB显色液销售。

⑨终止剂（1 mol／L H₂SO₄）600 ml双蒸水中，缓慢滴加浓硫酸100 ml，并不断搅拌，双蒸水补足至900 ml。

双抗体夹心法检测抗原的基本过程可分为如下几步：

A抗体包被（capture Ab） 用包被液（0.05 mol／L碳酸盐缓冲液，pH9.5或pH7.2 PBS，根据蛋白活性选择包被液）将抗体稀释至0.2～10 μg／ml，100 μl／孔，4 ℃过夜。

B洗板 弃去孔内溶液，吸水纸拍干，洗涤液洗3次，每孔大于250 μl，每次静置1分钟。

C封闭 加封闭液250 μl／孔，室温，静置1小时。

D洗板 重复步骤2。

E加样 用样本稀释液梯度稀释待检样品和标准品，100 μl／孔，室温，静置2小时；或4 ℃过夜（增加敏感性）。

F洗板 重复步骤2。

G加酶标抗体（detection Ab） 用样本稀释液稀释酶标抗体（使用前），100 μl／孔，室温，静置2小时。

H洗板 重复步骤2，洗板次数可增加至5次。

I加底物显色 加TMB底物溶液100 μl／孔，室温避光，静置5～15分钟。

J终止反应 加入1 mol／L H₂SO₄,50 μl／孔，振荡数秒混匀。

K结果判定

（1）定性：直接用肉眼观察结果，TMB经HRP催化后变为蓝色，加酸后转为黄色。反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅。

（2）定量：用酶标仪测定每孔在450 nm处的光吸收值。

（A450 mm），以标准品浓度为横坐标，标准品孔A450 mm值为纵坐标，绘制标准曲线，从而求出待检样品中抗原浓度。