简介
免疫沉淀法是蛋白质定性研究的一个有效方法，通常使用同位素标记的细胞裂解物，即放射性免疫沉淀检测法（RIPA）。沉淀后的样品经变性处理进行 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，然后烘干凝胶，进行放射自显影，根据放射自显影结果可以分析得到蛋白质的相对分子质量。由于使用了同位素标记蛋白质，这种方法敏感性很高。对于一些细胞内含量相对较高的蛋白质，可以不用放射性同位素标记细胞裂解物，实验方案方法相同，只是免疫沉淀后目的蛋白的检测是用 Western 印迹技术，而不是放射自显影。
原理
免疫沉淀法分离蛋白质的基本原理是是利用特异的抗体从细胞裂解物中分离目的蛋白的一种沉淀方法。该方法首先要制备细胞裂解液，然后将特异性抗体加到细胞裂解液中，4 ℃ 下孵育一定时间后，再加入可以与特异性抗体结合的固相化分子使之形成不溶性抗原-抗体复合物而沉淀。将沉淀下来的抗原-抗体复合物在含有 SDS 和 DTT 的缓冲液中加热后，使被沉淀的抗原释放出来，经电泳分离后即可用各种方法检测。
材料与仪器
器材：
电泳仪、垂直板电泳槽、干胶机、放射自显影用胶片盒、35S-甲硫氨酸标记的 HeLa 细胞裂解物。
试剂：
① 含 0.5 mol/L NaCl 的 RIPA 缓冲液
（NaCl（0.5 mol/L），29.22 g；Triton X-100（1%），10 ml；SDS（0.1%），1 g；去氧胆酸钠（1%），1 g；EDTA（5 mmol/L），1.86 g；10 mmol/L Tris-HCl（pH7.5），定容至 1000 ml）;
② 含 0.15 mol/L NaCl 的 RIPA 缓冲液
（NaCl 为 8.77 g，其他成分与 ① 缓冲液相同）;
③ NET 缓冲液
（NaCl（0.15 mol/L），8.77 g；EDTA（5 mmol/L），1.86 g；叠氮化钠（0.002%），20 mg; 50 mmol/L Tris-HCl（pH 7.5）, 1000 ml）。
④ Laemmli 缓冲液
（SDS（2%），0.2 g；DTT（50 mmol/L），77 mg；甘油（10%），1 ml；溴酚蓝（0.01%），1 mg；0.625 mol/L Tris-HCl（pH6.8）加至 10 ml）。
步骤
免疫沉淀法分离蛋白质的基本过程可分为如下几步：
（一）固定蛋白 A、G 或抗体的处理
固定蛋白 A、G 或抗体可以使用多种固相载体。预先包被过的葡聚糖微珠市场上有售。金黄色葡萄球菌 A 蛋白（Sp-A）方法是一个便利的办法，某些金黄色葡萄球菌外表面有蛋白 A，可用固定的细菌作为不溶性的蛋白 A。
A 将 Sp-A（整个细菌细胞）悬于水中，形成 10% Sp-A 的混悬液，以 100 μl 每管分装，贮存在 - 20 ℃ 待用。
B 临用前取出 Sp-A 的混悬液 12000 g 离心 1 min，弃上清液。
C 将沉淀重悬于 1 ml 含 0.5% NP-40 的 NET 缓冲液中。
D 室温下孵育 20 min。
E 12000 g 离心 15 min，弃上清液；沉淀重悬于 1 ml 含 0.05% NP-40 的 NET 缓冲液中。
F 室温下孵育 20 min。
G 12000 g 离心 1 min，弃上清液；沉淀重悬于 100 μl 含 0.05% NP-40、1 mg/ml 鸡卵清蛋白的 NET 缓冲液中。以下可进行 RIPA。
（二）免疫沉淀
A 取出 100 μl 35S-甲硫氨酸标记的细胞裂解物，加入 10 μl 特异的抗体，在 Eppendorf 管混匀。
B 4 ℃ 孵育至少 60 min，必要时孵育过夜。
C 加入 100 μl 经过处理的 10% Sp-A，4 ℃ 下轻轻旋摇孵育 60 min。
D 4 ℃，12000 g 离心 15～20 s，弃上清液。
E 用含有 0.5 mol/L NaCl 的 1 ml RIPA 缓冲液重悬沉淀。
F 涡旋、振荡后，1200 g 离心 15 s，弃上清液。
G 用同样的 RIPA 缓冲液洗涤 3 次。
H 用含有 0.15 mol/L NaCl 的 RIPA 缓冲液洗涤 3 次。
I 在 50 μl Laemmli 缓冲液中重悬沉淀物。
J 煮沸 5 min。
K 12000 g 离心 3 min，将上清液移至一支新试管中，- 20℃ 冻存待用。
L 将上清液 10 μl、蛋白质分子质量标准 10 μl 加样到 15% SDS-PAGE 凝胶上，40～50 V 条件下电泳，直至染料前沿至凝胶的边沿。
M 将凝胶浸泡在放射自显影强化液中 30 min 并不断搅动。用干胶机使凝胶干燥，将胶放在胶片上曝光保存。
注意事项
1 在 HeLa 细胞培养过程中用 35S-甲硫氨酸标记合成中的蛋白，要求条件较高，由有经验的人员来完成。
2 因使用放射性物质，操作者需要经过培训并需严格按规定操作，避免放射污染等意外的发生。
来源：丁香实验
