蛋白质分离实验

细胞实验

最新修订时间：2022-02-10

简介

蛋白质分离的方法主要有 3 种：SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离蛋白质、免疫沉淀法分离蛋白质和双向聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离蛋白质。

原理

SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离蛋白质的基本原理是蛋白质在 SDS 和巯基乙醇的作用下，分子中的二硫键还原，氢键打开，形成带负电荷的 SDS-蛋白质复合物，聚丙烯酰胺（PAGE）是一种具有三维结构的网状高分子聚合物，具有分子筛的作用。蛋白质在 PAGE 电泳中向正极迁移，迁移速率取决于分子的大小、电荷及其空间结构。SDS 带有较强的负电荷，不同的蛋白质与之结合后具有相同的荷质比，并具有相似的空间构象，使得 SDS-蛋白质复合物在 PAGE 中的迁移速率只与蛋白质的分子大小相关。

免疫沉淀法分离蛋白质的基本原理是是利用特异的抗体从细胞裂解物中分离目的蛋白的一种沉淀方法。该方法首先要制备细胞裂解液，然后将特异性抗体加到细胞裂解液中，4 ℃ 下孵育一定时间后，再加入可以与特异性抗体结合的固相化分子使之形成不溶性抗原-抗体复合物而沉淀。将沉淀下来的抗原-抗体复合物在含有 SDS 和 DTT 的缓冲液中加热后，使被沉淀的抗原释放出来，经电泳分离后即可用各种方法检测。

双向聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离蛋白质是根据蛋白质的两个一级属性-等电点和分子质量的特异性，将蛋白质混合物在电荷（等电聚焦，IEF）和分子质量（变性聚丙烯酰胺凝胺电泳，SDS-PAGE）两个水平上进行分离。2D-PAGE 的第一向电泳是等电聚焦电泳（IEF），蛋白质因所带净电荷的不同而被分离开；然后对蛋白质进行第二向电泳-SDS-PAGE，在 SDS-PAGE 中，不同分子质量的蛋白质相互间分离开。由于蛋白质的分子质量和所带净电荷是两个彼此不相关的重要性质，而 2D-PAGE 同时利用了蛋白质间在这两个性质上的差异分离蛋白质。

来源：丁香实验团队

操作方法

免疫沉淀法分离蛋白质

免疫沉淀法是蛋白质定性研究的一个有效方法，通常使用同位素标记的细胞裂解物，即放射性免疫沉淀检测法（RIPA）。沉淀后的样品经变性处理进行 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，然后烘干凝胶，进行放射自显影，根据放射自显影结果可以分析得到蛋白质的相对分子质量。由于使用了同位素标记蛋白质，这种方法敏感性很高。对于一些细胞内含量相对较高的蛋白质，可以不用放射性同位素标记细胞裂解物，实验方案方法相同，只是免疫沉

双向聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离蛋白质

高分辨的双向聚丙烯酰胺凝胶电泳（2D-PAGE）首先由 O'Farrell 于 1975 年创立，后经过 Anderson 实验室及其他实验室的改进与提高，这一技术日趋完善。2D-PAGE 的分离能力非常强大，它甚至能轻易地将细胞中的 5000 种蛋白分离开。正是由于它的强大分离能力，2D-PAGE 可用于研究基因突变、基因的表达和调控、蛋白质翻译后的修饰（如磷酸化、糖基化）。2D-PAGE 与其