膜蛋白质的分离
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在生物膜（biological membrane）双脂层的结构中，镶嵌着不同类型的蛋白质分子，统称为膜蛋白质。它执行着不同的功能，并构成细胞骨架(cytoskeleton)，其分子量分布在1万至24万。
生物膜的主要化学成分是脂类和蛋白质，此外还有糖类，它是以糖蛋白和糖脂的形式存在，生物膜不仅是细胞间的分隔物质和构成细胞的骨架，而且它与机体和细胞内的许多主要功能有关，如物质运输、信息交换、能量的传递、吸收作用和分泌作用以及兴奋的传导等，都与生物膜的结构有关。膜结构的完整性与正常机能的进行是密切相关的，而其中，膜结构上各类蛋白质又具有更重要的功能。当膜结构发生异常会导致功能的障碍和疾病的发生。因此，对生物膜的研究愈来愈受到各门类学科的重视。
对膜蛋白质的分离和组分的研究，现阶段以红细胞膜最多，Dodge等首先以低渗和高速离心法可去除血红蛋白和细胞内含物，而获得较纯净的血细胞膜，又称为血影（ghost），后来Fairbanks等又利用聚丙烯酰胺凝胶（polyacryamide gel）电泳方法对其蛋白质组分进行分离。
经研究发现，细胞膜上有两类蛋白质，一类蛋白质结合的不够紧密，经改变离子浓度或加入熬合剂（chllating agent），即可与膜分离，且溶于水，现在把这类蛋白质通称为边周蛋白（peripheral proteins）或表面蛋白（extinsic proteins），另一类蛋白质膜上的这类结合的较紧密，贯穿于膜的两侧，需经去垢剂、胆碱或有机溶剂处理后，才能从膜上分离出来，如果分离方法不当，容易使分子结构发生改变，其生物活性和功能也受到破坏。它及不溶于水溶液，这类蛋白质称之为内在蛋白（intrinsic proteins）或插入蛋白（integral proteins）。
膜中的蛋白质与脂类分子相结合，维持了细胞的完整性。现在对膜蛋白质的研究还很不完全，但一致认为膜上所有的蛋白质都是在一定的脂类环境中执行着一定的功能，有的是酶分子，有的是输送物质进出细胞的载体或泵，有的属于受体，有人已成功地把从细胞膜分离出来的蛋白质分子又重新组装到人工膜中，而仍保持其蛋白质的活性。
已经发现，很多蛋白质与糖结合形成糖蛋白，有人认为糖蛋白与稳定膜蛋白质的分子活性有关，也有人认为可使细胞膜的流动性增加，利用PAS的染色反应可显示出糖蛋白的存在。
操作方法：
（一）血影膜制备方法
实验步骤见图
1． 5ml全血，加入1~2倍的PBS， 1,000r×5min，4℃，离心。
2． 弃上清及中间层，留下层的压积的红细胞（packed RBC）。
3． 重复以上1~2次，洗涤被压积的红细胞。
4． 弃上清，留沉淀，即为浓缩的RBC。
5． 加入15~20倍的pH7.6的PBS，混匀，常温下，静置20~25min，低渗，
10,000~15,000r/min×15~20min，4℃，离心。
6． 弃上清（PBS和血红蛋白）、弃下层的粉红色扭状块（含大量蛋白酶），要清除干净，
否则会影响电泳结果，留中间的血影膜层。
7． 将团块状的沉淀，重复6步，洗涤1~2次，直至血影膜呈乳白色，弃上清液，沉淀
即为所制备的样品。
（二）样品的电泳分离
1． 制板
采用原盘或平板电泳，将5.6%胶用注射器注入电泳管或平板腔内，使胶液高度为110mm
左右，如发现胶液内留有气泡，应及时用长针头注射器清除，胶厚约为15~20mim，用注射器在胶液表面轻轻加入蒸馏水或电泳缓冲液，以防凝胶表面干结和氧化，在室温下放置4~5h或过夜，以进行固化处理。
2． 溶解样品
（1）按一份血影膜加入一份溶解液混匀。
（2）按总体加入DTT（final 40mol/L，约12.3mg/ml）。
（3）在90~100℃水浴中溶解3min，用自来水冷却至室温。
（4）加2～3滴考马斯亮蓝R-250混匀待用。
3． 电泳 细胞实验技术论坛 http://bbs.bbioo.com/forum-138-1.html
固化处理完成后，除去凝胶表面的水或电泳缓冲液，并除去底部的纸封或其它隔离物，
然后分别向电泳管顶端或平板样品孔内加入50～100ul溶解的样品，并在其上面加入电泳缓冲液。
按常规凝胶电泳方法加入电泳缓冲液，并接通电源，如系原盘电泳，开始5min内每管
1mA，5min后，每管3~5mA，如系平板电泳，开始5min内，每管1.5mA，之后，每管4~6mA。电源时间视指示剂（TD）移动情况而定，最快需2~3h，有时需5~6h。
在电源开始之前，应及时清除凝胶上下端存留的气泡。在电泳过程中，所用时间可根据指示剂，考马斯亮篮R-250所走的部位而定，当指示剂走向下端约1~1.5cm处，即可停止电泳。
4． 剥胶
如用圆柱电泳，可用长针头大号注射器吸满水，在靠电泳管的内壁插至1/3处，向里注
水并不断旋转电泳管，使其注射针头始终沿着电泳管的内壁与凝胶之间转动，切勿将针头直接插入凝胶内，以防止胶柱断裂。
用0.04%考马斯亮篮R-250染液，复染3~4h或过夜。
5． 脱色
其时间视脱色情况而定，待分带清晰，无带分布处基本透明时，即可停止。
（三）对血影蛋白成分的分析
按SDS聚丙烯凝胶电泳的位置，以移动距离的顺序，各条染色带命为bang1、2、3……
7（图2），在血影蛋白电泳扫描图中，图3是分离的膜蛋白各带峰的分布，其中H为剩余的血红蛋白，TD（tracking dye）是低分子示踪染料，图3下是PAS（periodic acid schiff）染色带扫描图，这种schiff过碘酸 试剂 对糖类染色具有专一性，因此可显示出糖蛋白的存在，这些糖蛋白统称为血型糖蛋白（glycophorin），其中PAS1，PAS2是主要染色带，二者又称glycophorinA，PAS3、PAS4也是糖蛋白，但含量极少。
生物膜的主要化学成分是脂类和蛋白质，此外还有糖类，它是以糖蛋白和糖脂的形式存在，生物膜不仅是细胞间的分隔物质和构成细胞的骨架，而且它与机体和细胞内的许多主要功能有关，如物质运输、信息交换、能量的传递、吸收作用和分泌作用以及兴奋的传导等，都与生物膜的结构有关。膜结构的完整性与正常机能的进行是密切相关的，而其中，膜结构上各类蛋白质又具有更重要的功能。当膜结构发生异常会导致功能的障碍和疾病的发生。因此，对生物膜的研究愈来愈受到各门类学科的重视。
对膜蛋白质的分离和组分的研究，现阶段以红细胞膜最多，Dodge等首先以低渗和高速离心法可去除血红蛋白和细胞内含物，而获得较纯净的血细胞膜，又称为血影（ghost），后来Fairbanks等又利用聚丙烯酰胺凝胶（polyacryamide gel）电泳方法对其蛋白质组分进行分离。
经研究发现，细胞膜上有两类蛋白质，一类蛋白质结合的不够紧密，经改变离子浓度或加入熬合剂（chllating agent），即可与膜分离，且溶于水，现在把这类蛋白质通称为边周蛋白（peripheral proteins）或表面蛋白（extinsic proteins），另一类蛋白质膜上的这类结合的较紧密，贯穿于膜的两侧，需经去垢剂、胆碱或有机溶剂处理后，才能从膜上分离出来，如果分离方法不当，容易使分子结构发生改变，其生物活性和功能也受到破坏。它及不溶于水溶液，这类蛋白质称之为内在蛋白（intrinsic proteins）或插入蛋白（integral proteins）。
膜中的蛋白质与脂类分子相结合，维持了细胞的完整性。现在对膜蛋白质的研究还很不完全，但一致认为膜上所有的蛋白质都是在一定的脂类环境中执行着一定的功能，有的是酶分子，有的是输送物质进出细胞的载体或泵，有的属于受体，有人已成功地把从细胞膜分离出来的蛋白质分子又重新组装到人工膜中，而仍保持其蛋白质的活性。
已经发现，很多蛋白质与糖结合形成糖蛋白，有人认为糖蛋白与稳定膜蛋白质的分子活性有关，也有人认为可使细胞膜的流动性增加，利用PAS的染色反应可显示出糖蛋白的存在。
操作方法：
（一）血影膜制备方法
实验步骤见图
1． 5ml全血，加入1~2倍的PBS， 1,000r×5min，4℃，离心。
2． 弃上清及中间层，留下层的压积的红细胞（packed RBC）。
3． 重复以上1~2次，洗涤被压积的红细胞。
4． 弃上清，留沉淀，即为浓缩的RBC。
5． 加入15~20倍的pH7.6的PBS，混匀，常温下，静置20~25min，低渗，
10,000~15,000r/min×15~20min，4℃，离心。
6． 弃上清（PBS和血红蛋白）、弃下层的粉红色扭状块（含大量蛋白酶），要清除干净，
否则会影响电泳结果，留中间的血影膜层。
7． 将团块状的沉淀，重复6步，洗涤1~2次，直至血影膜呈乳白色，弃上清液，沉淀
即为所制备的样品。
（二）样品的电泳分离
1． 制板
采用原盘或平板电泳，将5.6%胶用注射器注入电泳管或平板腔内，使胶液高度为110mm
左右，如发现胶液内留有气泡，应及时用长针头注射器清除，胶厚约为15~20mim，用注射器在胶液表面轻轻加入蒸馏水或电泳缓冲液，以防凝胶表面干结和氧化，在室温下放置4~5h或过夜，以进行固化处理。
2． 溶解样品
（1）按一份血影膜加入一份溶解液混匀。
（2）按总体加入DTT（final 40mol/L，约12.3mg/ml）。
（3）在90~100℃水浴中溶解3min，用自来水冷却至室温。
（4）加2～3滴考马斯亮蓝R-250混匀待用。
3． 电泳 细胞实验技术论坛 http://bbs.bbioo.com/forum-138-1.html
固化处理完成后，除去凝胶表面的水或电泳缓冲液，并除去底部的纸封或其它隔离物，
然后分别向电泳管顶端或平板样品孔内加入50～100ul溶解的样品，并在其上面加入电泳缓冲液。
按常规凝胶电泳方法加入电泳缓冲液，并接通电源，如系原盘电泳，开始5min内每管
1mA，5min后，每管3~5mA，如系平板电泳，开始5min内，每管1.5mA，之后，每管4~6mA。电源时间视指示剂（TD）移动情况而定，最快需2~3h，有时需5~6h。
在电源开始之前，应及时清除凝胶上下端存留的气泡。在电泳过程中，所用时间可根据指示剂，考马斯亮篮R-250所走的部位而定，当指示剂走向下端约1~1.5cm处，即可停止电泳。
4． 剥胶
如用圆柱电泳，可用长针头大号注射器吸满水，在靠电泳管的内壁插至1/3处，向里注
水并不断旋转电泳管，使其注射针头始终沿着电泳管的内壁与凝胶之间转动，切勿将针头直接插入凝胶内，以防止胶柱断裂。
用0.04%考马斯亮篮R-250染液，复染3~4h或过夜。
5． 脱色
其时间视脱色情况而定，待分带清晰，无带分布处基本透明时，即可停止。
（三）对血影蛋白成分的分析
按SDS聚丙烯凝胶电泳的位置，以移动距离的顺序，各条染色带命为bang1、2、3……
7（图2），在血影蛋白电泳扫描图中，图3是分离的膜蛋白各带峰的分布，其中H为剩余的血红蛋白，TD（tracking dye）是低分子示踪染料，图3下是PAS（periodic acid schiff）染色带扫描图，这种schiff过碘酸 试剂 对糖类染色具有专一性，因此可显示出糖蛋白的存在，这些糖蛋白统称为血型糖蛋白（glycophorin），其中PAS1，PAS2是主要染色带，二者又称glycophorinA，PAS3、PAS4也是糖蛋白，但含量极少。
