双 PAG 法

1. 石蜡切片常规脱蜡至水，0.05 mol/L（pH 7.4）TBS 洗 3×3 min。

2. 0.1％ 胰蛋白酶 37℃ 消化 20 min，或抗原修复 20 min（98℃），自然冷却至室温。

3. 0.05 mol/L（pH 7.4）TBS 洗 3×3 min。

4. 1％ EA（卵蛋白）15 min，不洗。

5. 适当稀释的特异抗体室温 4 h 或 4℃ 孵育 20 h，或 37℃ 孵育 1 h。

6. 0.05 mol/L（pH 7.4）TBS 洗 3×5 min。

7. 0.02mol/L（pH 7.4）TBS（内含 0.1％ BSA）洗 10 min。

8. 1％ EA 15 min，不洗，滴加 PAG 10 nm 1:40 稀释，室温 1 h，或 37℃ 孵育 30 min。

9. 0.05 mol/L（pH 7.4）TBS 洗 10 min。

10. 兔抗 SPA IgG 1:400 稀释，37℃ 30 min。

11. 0.05 mol/L（pH 7.4）TBS 洗 10 min。

12. 滴加 PAG 10nm 1:60 稀释，室温 1 h，或 37℃ 30 min。

13. 0.05 mol/L（pH 7.4）TBS 洗 10 min。

14. 1％ 戊二醛洗 10 min。

15. 双蒸水洗 5 min。

16. 1％ 明胶洗 5 min。

17. 银避光显影 8～15 mm。

18. 双蒸水洗 15 min。

19. 固定：用显影定影液（1:4 或 1:10）固定 5 min，也可以用 15％ 硫酸钠-20％ 硫代硫酸钠混合液固定 1～3 min，或用 1％ 戊二醛固定 5 min，50℃ 温水洗 3～6 min。

20. 衬染：核固红衬染 3 min 或甲基绿衬染 3 min。

21. 常规脱水，树胶封片。

22. 镜检：阳性物质呈黑色或黑褐色，颗粒分布于抗原-抗体反应部位；背景较干净，呈红色。