IGS 间接法
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原理
免疫金染色(immunogold staining,IGS)法是由 Geoghegan 等(1978)首次应用金标探针检测 B 淋巴细胞表面抗原,将胶体金颗粒(大于 20 nm)标记在第二抗体或 SPA 分子上,制备成金标二抗。其原理是当特异性抗体与抗原结合后,用金标二抗或金标 SPA 与特异性抗体结合,形成抗原-抗体-金标抗体复合物,此时在光镜(10 × 100 倍)下可见红色颗粒物,即为抗原-抗体结合物。该方法特点简便、快速(因不需银显影),要求金标抗体浓度高,而且金颗粒直径大于 20 nm。
材料与仪器
步骤
1. 4 μm 石蜡切片常规脱蜡至水,0.05 mol/L(pH 7.4)TBS 洗 2 × 3 min。
2. 1% 卵蛋白 [EA,用 0.05 mol/L(pH 7.4)TBS 稀释] 温育 15 min,不洗。
3. 加入适当稀释特异性抗体,37℃ 温育 1 h,0.05 mol/L(pH 7.4)TBS 洗 2 × 3 min。
4. 0.02 mol/L(pH 7.4)TBS(内含 0~1% BSA)洗 10 min。
5. 1% 卵蛋白温育 15 min,不洗。
6. 适当稀释的金标记 SPA 30 nm(PAG 30 nm)室温孵育 1~2 h,0.05 mol/L(pH 7.4)TBS 洗 3 × 3 min。
7. 双重蒸馏水洗 5 min,1% 戊二醛洗 10 min,双重蒸馏水洗 5 min。
8. 用 0.01% 伊文斯蓝衬染 3 min,50% 缓冲甘油封片。
9. 结果观察:阳性呈现红色细颗粒状。
来源:丁香实验