免疫金银染色双PAG法

免疫金银染色方法敏感、简便、省时、安全可靠，葡萄球菌A蛋白（SPA）金标记四步法是在此基础上发展起来的更为敏感的一种新方法。SPA和许多哺乳类动物IgG具有亲和性，且它们之间的连接不会干扰抗原——抗体的结合。

简单的SPA金标记二步法后，第三步用抗SPA与SPA金表面分子通过Fab或Fc段相结合，结果结合更多的胶体金颗粒，再通过银增强，使原始信号得到几何级放大，其染色原理见图。

双PAG免疫金银染色原理

（一）染色流程：

（1）石蜡切片常规脱蜡至水，0.05mol/L（pH7.4）TBS洗3×3min.

（2）0.1%胰蛋白酶37℃消化20min,或抗原修复20min（98℃），自然冷却至室温。

（3）0.05mol/L（pH7.4） TBS洗3×3min.

（4）1%EA（卵蛋白）15min,不洗。

（5）适当稀释的特异抗体室温4h或4℃孵育20h,或37C孵育30min.

（6）0.05mol/L（pH7.4）TBS洗3×5min.

（7）0.02mol/L（pH7.4）TBS（内含0.1%BSA）洗10min.

（8）1%EA 15min,不洗，滴加PAGlonm 1:40稀释，室温1h,

（9）0.05mo!/L（pH7.4）TBS洗10min.

（10）兔抗SPAIgGl:400稀释，37℃ 30min.

（11）0.05mol/L（pH7.4）TBS洗10min.

（12）滴加PAGlonm 1:60稀释，室温1h,或37℃ 30min.

（13）0.05mol/L（pH7.4）TBS洗10min.

（14）1%戊二醛洗10min.

（15）双蒸水洗5min.

（16）1%明胶洗5min.

（17）银避光显影8~15min.

（18）双蒸水洗15min.

（19）固定：用显影定影液（1:4或1:10）固定5min,也可以用15%硫酸钠-20%硫代硫酸钠混合液固定1~3rain，或用1%戊二醛固定5min,50℃温水洗3~6min.

（20）衬染：核固红衬染3min或甲基绿衬染3min.

（21）常规脱水，树胶封片。

（22）镜检：阳性物质呈黑色或黑褐色，颗粒分布于抗原-抗体反应部位；背景较干净，呈红色。

（二）双PAG法的敏感性

应用本法对keratin、AFP、HBsAg、FN、SOD、HCG、F8、P53等组织抗原的定位，连续4gm石蜡切片，同时用IGSS和双PAG法，不同的一抗稀释度，结果双PAG法要比IGSS法敏感5~8倍，抗体的稀释度从1:  （1000~5000）提高到1:  （10000-50000），大大节约了第一抗体。尤其组织细胞内抗原性较弱，抗原丢失严重，应用双PAG法均能得到有效的检测，阳性检测率和阳性强度有了明显的提高。某些抗原用单一的SPA金标探针对某些抗原只能获得低强度的染色，当用双PAG法时可获得强的特异性染色。