免疫金银染色双PAG法的操作步骤

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免疫金银染色方法敏感、简便、省时、安全可靠，葡萄球菌A蛋白(SPA)金标记四步法是在此基础上发展起来的更为敏感的一种新方法。SPA和许多哺乳类动物IgG具有亲和性，且它们之间的连接不会干扰抗原 ——抗体的结合。简单的SPA金标记二步法后，第三步用抗SPA与SPA金表面分子通过Fab或Fc段相结合，结果结合更多的胶体金颗粒，再通过银增强，使原始信号得到几何级放大，其染色原理见图。

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双PAG免疫 金银染色原理

(一)染色流程：

(1)石蜡切片常规脱蜡至水，0.05mol/L(pH7.4)TBS洗3×3min.

(2)0.1%胰蛋白酶37℃消化20min,或抗原 修复20min(98℃)，自然冷却至室温。

(3)0.05mol/L(pH7.4) TBS洗3×3min.

(4)1%EA(卵蛋白)15min,不洗。

(5)适当稀释的特异抗体室温4h或4℃孵育20h,或37C孵育30min.

(6)0.05mol/L(pH7.4)TBS洗3×5min.

(7)0.02mol/L(pH7.4)TBS(内含0.1%BSA )洗10min.

(8)1%EA 15min,不洗，滴加PAGlonm 1:40稀释，室温1h,

(9)0.05mo!/L(pH7.4)TBS洗10min.

(10)兔抗SPAIgGl:400稀释，37℃ 30min.

(11)0.05mol/L(pH7.4)TBS洗10min.

(12)滴加PAGlonm 1:60稀释，室温1h,或37℃ 30min.

(13)0.05mol/L(pH7.4)TBS洗10min.

(14)1%戊二醛洗10min.

(15)双蒸水洗5min.

(16)1%明胶洗5min.

(17)银避光显影8~15min.

(18)双蒸水洗15min.

(19)固定：用显影定影液(1:4或1:10)固定5min,也可以用15%硫酸钠-20%硫代硫酸钠混合液固定1~3rain，或用1%戊二醛固定5min,50℃温水洗3~6min.

(20)衬染：核固红衬染3min或甲基绿衬染3min.

(21)常规脱水，树胶封片。

(22)镜检：阳性物质呈黑色或黑褐色，颗粒分布于抗原 -抗体反应部位;背景较干净，呈红色。

(二)双PAG法的敏感性

应用本法对keratin、AFP、HBsAg、FN、SOD、HCG、F8、P53等组织抗原的定位，连续4gm石蜡切片，同时用IGSS和双PAG法，不同的一抗稀释度，结果双PAG法要比IGSS法敏感5~8倍，抗体的稀释度从1: (1000~5000)提高到1: (10000-50000)，大大节约了第一抗体。尤其组织细胞内抗原性较弱，抗原丢失严重，应用双PAG法均能得到有效的检测，阳性检测率和阳性强度有了明显的提高。某些抗原用单一的SPA金标探针对某些抗原只能获得低强度的染色，当用双PAG法时可获得强的特异性染色。