改进 CSA法

已有的研究结果证实，CSA 法较 LSAB 法敏感 500～1000 倍，较 EnVision 法敏感 20～100 倍。其对细胞周期素等核内抗原的定位，有独特的优点，定位准确性、敏感性、稳定性要较标准的 CSA 法好，其敏感性和穿透性要好于 EnVision 法。最近，Hasui K 等（2005）的研究结果表明，CSA 法具有很高的敏感性的同时，也存在严重的内源性物质干扰（内源性生物素、内源性过氧化物酶、第一抗体与组织细胞内的不明物质的非特异性结合），尤其是经抗原热修复后情况更为严重。作者应用标准的 EnVision 法、CSA 法和改进（加阻断剂）的 CSA 法检测淋巴结、正常肝、肝细胞癌、胃肠道鳞癌及癌周正常组织中 ki-67 抗原即为如此。<link />

石蜡切片
H2O2 甲醇 PBS 蛋白阻滞剂 酪胺 EnVision复合物 链霉亲和素-HRP 生物素 DAB

1. 4 μm 石蜡切片常规脱蜡至水，PBS 洗 3×3 min。

2. 首先用 0.3％ 过氧化氢甲醇破坏内源性过氧化物酶的活性，室温 20 min。

3. PBS 洗 3×3 min。

4. 抗原修复，室温冷却 20 min。

5. PBS 洗 3×3 min。

6. 第二次用 0～3％ 过氧化氢 PBS 破坏内源性过氧化物酶的活性，室温 5 min。

7. 用温的（35℃）TBST [0.02 mol/L（pH 7.8）Tris-HCl+NaCl+0.1％ Tween 20] 洗 3×3 min。

8. 滴加蛋白阻断剂（0.25％ 酪蛋白），以阻断第一抗体的非特异性结合位点，10 min，不洗。

9. 滴加适当稀释的第一抗体（在 S-P 法基础上 5～10 倍稀释），37℃ 孵育 15～60 min，或 4℃ 过夜。

10. PBS 洗 3×3 min，温的（35℃）TBST 洗 3×3 min。

11. 滴加蛋白阻断剂（0.25％ 酪蛋白），以阻断多聚物试剂的非特异性结合位点，10 min，不洗。

12. 多聚物（EnVision）孵育 15 min，温热（35℃）TBST 洗 3×3 min。

13. 滴加蛋白阻断剂（0.25％ 酪蛋白），以阻断 CSA 试剂的非特异性结合位点，10 min，不洗；如用荧光素标记酪胺需用 TBST 洗 3 次。

14. 用生物素标记酪胺孵育 15 min；如用荧光素标记酪胺孵育 15～30 min。温热（35℃）TBST 洗 3×3 min。

15. 链霉亲和素-HRP 37℃ 孵育 15 min 或 HRP 标记的抗 FITC 抗体孵育 30 min，温的（35℃）TBST 洗 3×3 min。

16. 0.04％ DAB（含 0.03％ H₂O₂）显色 5～10 min。

17. 复染、脱水、常规树胶封固和结果观察。

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