原理
催化信号放大系统(catalyzed signal amplification system,CSA),也称酿胺信号放大(tyramine signal amplification system,TSA)或称 CARD(catalyzed repoter deposition)。
该方法的主要原理是酪胺的过氧化物酶反应(即 HRP 在 H2O2 存在下催化酪胺盐,形成共价键结合位点),产生大量的酶促产物,该产物能与周围的蛋白残基(包括色氨酸、组氨酸和酪氨酸残基)结合,这样在抗原-抗体结合部位就有大量的生物素沉积,与随后加入的链霉亲和素-HRP 结合,如经几次这样的循环放大,可以网络许许多多的酶分子,最后通过 DAB 的显色反应,其敏感性得到几何级放大。其感性较常规 LSAB 法要高近 1000 倍,特别适用于石蜡切片较难检出结果的组织片。
材料与仪器
生物素 N-羟基丁二酸亚胺酯 酪胺盐 二甲基甲酰胺 三乙醇胺 硼酸缓冲液 2 4 6-三硝基苯亚磺酸 蛋白酶 PBS H2O2 特异性一抗 生物素化二抗 链霉亲和素-HRP 树胶
步骤
实验试剂制备流程:
①A 液:临用前将 Bio-NHS 溶在 DMF 中(10 mg/ml)。
②B 液:10 mg/ml 酪胺盐溶在 DMF 中(相当于 58 μmol/L),加入 1.25 倍量的 TEA(从 7.2mol/L 的贮存液中取 10 μl)。
③C 液:在 A 液中加入 1.1 倍摩尔浓度的 B 液,在暗处使充分酰化 2 h,最后用乙醇稀释到 1 mg/ml。C 液在 4℃ 中可保存 8 个月,临用前加入终浓度为 0.003% 的 H2O2。可 1:500 稀释。
步骤:
1. 4 μm 石蜡切片常规脱蜡至水,PBS 洗 3×3 min。
2. IHC 的前处理视特异性一抗不同,可采用蛋白酶消化,或热诱导的微波抗原修复(AR)。
3. PBS 洗 3×3 min。
4. 3% 过氧化氢孵育 10 min(可省略),以阻断内源性过氧化物酶活性。
5. PBS 洗 3×3 min。
6. 20% 蛋清 [ 用 0.01 mol/L(pH 7.3)PBS 配制 ] 孵育 20 min。
7. PBS 洗 3×3 min。
8. 10% 非免疫性动物血清孵育 10 min(可省略),以减少非特异性背景,无需冲洗,只需吸去多余血清。
9. 滴加适当稀释的第一抗体(在 S-P 法基础上 5~10 倍稀释),37℃ 孵育 60 min,或 4℃ 过夜。
10. PBS 洗 3×3 min。
11. 滴加生物素化二抗,37℃ 孵育 30 min。
12. PBS 洗 3×3 min。
13. 链霉亲和素-HRP37℃ 孵育 30 min,PBS 洗 3×3 min;0.007mol/L 生物素化酪胺酰胺(内含 0.03% H2O2)37℃ 孵育 12 min,PBS 洗 3×3 min。
14. 链霉亲和素-HRP 37℃ 孵育 15 min,PBS 洗 3×3 min。
15. 如果信号弱,还可以从第(14)步开始重复几次,使阳性信号获得明显改善为止。
16. 0.04% DAB(含 0.03% H2O2)显色 5~10 min。
17. 复染、脱水、常规树胶封固和结果观察。
来源:丁香实验