双 PAP 法（非标记抗体免疫酶组织化学实验）

在 PAP 法的基础上重复第二抗体和 PAP 复合物，重复的连接抗体和 PAP 复合物可能有以下两种连接方式（图 4-10）。第一种（A）重复连接抗体可与一个 PAP 中的抗 HRP 抗体上未饱和的 Fc 段结合，再与后加的 PAP 复合物相结合；第二种（B）重复连接抗体与特异性一抗分子上未饱和的 Fc 段相结合，第一抗体上结合了更多的桥抗体和 PAP 复合物。正是这两种连接方式，对抗原有了进一步放大作用，因而提高了 PAP 法的敏感性。但该方法也存在以下缺点：步骤多、费时、非特异性背景加重，因洗涤多而使脱片率提高。

石蜡切片 动物血清
蛋白酶 特异性一抗 桥抗体 PAP 复合物 PBS DAB H2O2 BAB
滴管 玻片

1. 4 μm 石蜡切片 58℃ 烤片 4 h，切片常规脱蜡至水。

2. 蛋白酶消化或 AR（组织抗原的暴露或抗原的修复，此步视情况而定）。

3. 0.3％ H₂O₂ 处理切片 20 min（室温），PBS 洗 3 min × 2 次。

4. 3％ 正常动物血清处理切片 30 min（室温），吸去多余血清，不洗。

5. 适当稀释的特异性一抗孵育（4℃ 过夜或 37℃60 min），PBS 洗 3 min × 3 次。

6. 滴加桥抗体（二抗），37℃ 孵育 40 min，PBS 洗 3 min × 3 次。

7. 适当稀释的 PAP 复合物（要求与特异性一抗同一种属）37℃ 孵育 40 min。

8. PBS 洗 3 min×3 次。

9. 重复步骤 6～8。

10. 常规 BAB-H₂O₂ 显色。

11. 水洗、复染、脱水、封片。

1. 假阴性及其处理

应用 PAP 法显示抗原含量较多的组织或冰冻切片抗原保存良好的标本时，可导致阴性结果。Bigbee（1977）的研究证实，阴性结果是由于第一抗体用董过高，与组织抗原结合过多，使相邻两个抗体的 Fc 段间的距离恰好是连接抗体的两个 Fab 段结合的长度，于是连接抗体不存在游离 Fab 段，仅存无活性的 Fc 段，所以不能将 PAP 复合物连接在与组织抗原结合的第一抗体上，导致阴性结果。尤其是冰冻切，而石蜡切片很少发生这种现象。克服的办法是将第一抗体尽量稀释。

2. 桥抗体

也称连接抗体。它的两个 Fab 段具有相同的结构、性质及与抗原结合的能力，因此，当第一抗体和 PAP 复合中抗 HRP 抗体来自同一种属动物时，桥抗体能同时与上述二种抗体结合，起到桥的作用。为丁确保桥抗体的二个 Fab 段之一与第一抗体结合，另一个与抗 HRP 抗体结合，桥抗体的浓度必须高于常规用的第二抗体。

3.PAP 复合物

在 PAP 法和酶桥法中，特别强调第一抗体和抗 HRP 必须来自同一种属，桥抗体才能发挥桥的作用，将其连接在一起。