非标记抗体免疫酶组织化学实验

免疫学实验

最新修订时间：2022-02-10

简介

由于在酶标记抗体过程中，酶与抗体的结合可损害部分抗体和酶的活性，从而降低了抗体的效价。另外，血清中的非特异性抗体也可以被酶标记，这些非特异酶标记抗体与组织中相应抗原结合，放大了非特异背景染色。为了避免酶标记抗体法的上述缺点，Sternberger（1969）在酶标抗体法的基础上，创建了非标记抗体免疫酶技术。该方法先用酶（HRP 或 AKP）去免疫动物（羊、兔和鼠等），使其产生高效价、特异性的抗酶抗体，再将该抗酶抗体与酶结合，形成五环的复合物，例如 PAP（HRP）、APAAP（AKP）、OAGO（GO）复合物。该复合物由于没有一个抗体受到共价键的标记，保留了免疫活性，相对分子质量较小，对细胞的穿透性好。该技术主要有酶桥法和过氧化物酶抗过氧化物酶（PAP）复合物法，以及一些变型的方法。特别是 PAP 法大大提高了检测的敏感性，且染色背景轻，稳定性好，得到了广泛应用。

内容来源于《免疫组织化学实验技术及应用》

来源：丁香实验

操作方法

酶桥法

1. 石蜡切片脱蜡至水，冰冻切片或细胞涂片经丙酮固定 10 min，PBS 洗 3 min × 3 次。2. 滴加 0.3% H2O2 甲醇液，室温处理 20 min，PBS 洗 3 min × 3 次（抑内源性过氧化物酶活性）。3. 0.1% 胰蛋白酶 37°C 消化 20 min 或 AR（只限于石蜡片），PBS 洗 3 min × 3 次。4. 滴加 1:（5～20）正常羊血清或牛血清 20

PAP 法（非标记抗体免疫酶组织化学实验）

1. 4 μm 石蜡切片 58℃ 烤片 4 h，切片常规脱蜡至水。 2. 蛋白酶消化或 AR（组织抗原的暴露或抗原的修复，此步视情况而定）。 3. 0.3％ H2O2 处理切片 20 min（室温），PBS 洗 3 min × 2 次。 4. 3％正常动物血清处理切片 30 min（室温），吸去多余血清，不洗。 5. 适当稀释的特异性一抗孵育（4℃ 过夜或 37℃60 min），PBS 洗 3

双 PAP 法（非标记抗体免疫酶组织化学实验）

ABPAP 法

1. 4 μm 石蜡切片 58℃ 烤片 4 h，切片常规脱蜡至水，PBS 洗 3 min×3 次。2. 蛋白酶消化或 AR（组织抗原的暴露或抗原的修复，此步视情况而定）。3. 0.3％ H2O2 处理切片 20 min（室温），PBS 洗 3 min × 2 次。4. 3％正常动物血清处理切片 30 min（室温），吸去多余血清，不洗。5. 适当稀释的特异性一抗孵育（4℃ 过夜或 37℃ 60