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非标记抗体免疫酶组织化学实验

实验分类:

免疫学实验

最新修订时间:

简介

由于在酶标记抗体过程中,酶与抗体的结合可损害部分抗体和酶的活性,从而降低了抗体的效价。另外,血清中的非特异性抗体也可以被酶标记,这些非特异酶标记抗体与组织中相应抗原结合,放大了非特异背景染色。为了避免酶标记抗体法的上述缺点,Sternberger(1969)在酶标抗体法的基础上,创建了非标记抗体免疫酶技术。该方法先用酶(HRP 或 AKP)去免疫动物(羊、兔和鼠等),使其产生高效价、特异性的抗酶抗体,再将该抗酶抗体与酶结合,形成五环的复合物,例如 PAP(HRP)、APAAP(AKP)、OAGO(GO)复合物。该复合物由于没有一个抗体受到共价键的标记,保留了免疫活性,相对分子质量较小,对细胞的穿透性好。该技术主要有酶桥法和过氧化物酶抗过氧化物酶(PAP)复合物法,以及一些变型的方法。特别是 PAP 法大大提高了检测的敏感性,且染色背景轻,稳定性好,得到了广泛应用。


内容来源于《免疫组织化学实验技术及应用》


来源:丁香实验

操作方法

酶桥法

1. 石蜡切片脱蜡至水,冰冻切片或细胞涂片经丙酮固定 10 min,PBS 洗 3 min × 3 次。2. 滴加 0.3% H2O2 甲醇液,室温处理 20 min,PBS 洗 3 min × 3 次(抑内源性过氧化物酶活性)。3. 0.1% 胰蛋白酶 37°C 消化 20 min 或 AR(只限于石蜡片),PBS 洗 3 min × 3 次。4. 滴加 1:(5~20)正常羊血清或牛血清 20

PAP 法

1. 4 μm 石蜡切片 58℃ 烤片 4 h,切片常规脱蜡至水。2. 蛋白酶消化或 AR(组织抗原的暴露或抗原的修复,此步视情况而定)。3. 0.3% H2O2 处理切片 20 min(室温),PBS 洗 3 min × 2 次。4. 3% 正常动物血清处理切片 30 min(室温),吸去多余血清,不洗。5. 适当稀释的特异性一抗孵育(4℃ 过夜或 37℃60 min),PBS 洗 3 min

双 PAP 法

1. 4 μm 石蜡切片 58℃ 烤片 4 h,切片常规脱蜡至水。2. 蛋白酶消化或 AR(组织抗原的暴露或抗原的修复,此步视情况而定)。3. 0.3% H2O2 处理切片 20 min(室温),PBS 洗 3 min × 2 次。4. 3% 正常动物血清处理切片 30 min(室温),吸去多余血清,不洗。5. 适当稀释的特异性一抗孵育(4℃ 过夜或 37℃60 min),PBS 洗 3 min

ABPAP 法

1. 4 μm 石蜡切片 58℃ 烤片 4 h,切片常规脱蜡至水,PBS 洗 3 min×3 次。2. 蛋白酶消化或 AR(组织抗原的暴露或抗原的修复,此步视情况而定)。3. 0.3% H2O2 处理切片 20 min(室温),PBS 洗 3 min × 2 次。4. 3% 正常动物血清处理切片 30 min(室温),吸去多余血清,不洗。5. 适当稀释的特异性一抗孵育(4℃ 过夜或 37℃ 60

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