非标记抗体免疫电镜

原理

 

标记抗体法虽然具有许多优点，但也存在一些难以克服的问题，如标记抗体的分子增大，对细胞膜和组织的穿透力减弱；化学交联反应对抗体和酶的活性有所影响；结合物中未标记的抗体可与抗原竞争结合，影响检测方法的敏感性等。不标记抗体法可以避免上述的不利影响因素，通过一系统的非标记抗体的免疫学反应，对组织中的抗原进行定位检测。不标记抗体法又可分为用标记物显示和不同标记物显示两种方法。前者利用基因工程方法制备双特异性抗体的 F(ab^′ )₂ ，一个 Fab 片段与标本中的抗原结合，一个 Fab 是抗体蛋白的结合片段。在抗体与标本作用后，再加入铁蛋白与抗体结合，从而显示组织内抗原的所在部位。后者则用磷酸钨负染后，直接电镜观察。

 

 

 

材料及试剂

 

1 ．待检病毒材料 如粪便，气管分泌物、脑脊髓液、组织培养液等。

2 ．高速离心机

3 ．已知抗体

4 ．磷钨酸

5 ．琼脂糖

6 ．其它

 

 

 

操作方法

 

1 ．经典法

（ 1 ）将被检病毒材料 0.9ml ，加 1 ︰ 5 ～ 1 ︰ 10 稀释的特异性免疫血清 0.1ml 充分混合。

（ 2 ）置 37 ℃ 作用 1h 或 37 ℃ 1h 后再置 4 ℃ 过夜。

（ 3 ）以 17 000r/min ～ 23 000r/min 离心 90min 。

（ 4 ）吸去上清，将离心管口倒置于滤纸上，吸去残留液体。

（ 5 ）沉淀物中加少量 H₂ O 混悬，用 3% 磷钨酸 (pH6.0) 负染 20Sec ～ 30Sec ，滴加于 400 目铜网 Fomnvar 膜上，用滤纸从铜网边缘轻轻吸去多余的负染液。

（ 6 ）在透射电镜下 4 × 10⁴ 倍观察。

2 ．快速法 ( 琼脂扩散法 )

（ 1 ）同经典法 (1) 、 (2) 步骤，制备免疫复合物。

（ 2 ）以生理盐水或 pH 7.2 巴比妥缓冲液制备 1% 琼脂糖，趁热浇注于洁净的载玻片上，每片 3ml ，待冷却凝固后，在凝胶面上等距离放置直径 4mm 玻璃珠数粒，再于凝胶面上浇注 1% 琼脂糖 2ml ～ 3ml ，冷却凝固后，取出玻璃珠，使凝胶形成凹孔。

（ 3 ）将普通滤纸剪成 2 × 3cm 大小， 3 ～ 4 层重叠。用小刀将带有凹孔的琼脂糖切成小块 , 每块带有一个凹孔 , 平放在滤纸上。

（ 4 ）在凹孔内，加入制备好的含病毒的免疫复合物悬液。

（ 5 ）将电镜载网的 Fomnvar 膜面向下倒悬于液滴上。由于琼脂糖的吸水作用， 20min ～ 30min 后，可将液滴的水分吸干，而浓缩的免疫复合物则粘附在载网膜上。

（ 6 ）在载网膜上滴加 3% 磷钨酸负染 20Sec ，过量的负染液用滤纸在载网边缘轻轻吸去。

（ 7 ）于透射电镜 4 × 10⁴ 倍下观察。

 

 

 

结果判定

 

直接观察病毒粒子的形态。由于离心浓缩的处理和特异性抗体的加入，大大提高了观察的敏感性。