酶桥法

首先用酶免疫动物制备成效价高、特异性强的抗酶抗体。在特异性抗体与抗酶抗体之间利用第二抗体作「桥梁」，将它们连接起来，再将酶结合在抗酶抗体上，经显色显示抗原的定位。

其基本流程为：抗原+特异性抗体 → 第二抗体（桥抗）→ 抗 HRP 抗体 → HRP → DAB+H₂O₂（显色）。

因为桥抗体对特异性抗体的量是过剩的，与特异性抗体结合后还剩有抗原结合位点，能与抗酶抗体结合，所以桥抗体能起到连接特异性抗体和抗酶抗体的作用。在此过程中，酶是利用免疫学原理与抗酶抗体结合的，从而避免了由于酶标记抗体而引起的酶和抗体的活性损害，提高了方法的敏感性，降低了非特异性染色。染色原理见图 4-7。

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石蜡切片 动物血清 冰冻切片细胞涂片
胰蛋白酶 特异性一抗 桥抗体 PBS DAB H2O2 丙酮 甲醇 抗酶抗体 HRP 酶 苏木精 盐酸乙醇 乙醇 树胶
滴管 玻片

1. 石蜡切片脱蜡至水，冰冻切片或细胞涂片经丙酮固定 10 min，PBS 洗 3 min × 3 次。

2. 滴加 0.3% H₂O₂ 甲醇液，室温处理 20 min，PBS 洗 3 min × 3 次（抑内源性过氧化物酶活性）。

3. 0.1% 胰蛋白酶 37°C 消化 20 min 或 AR（只限于石蜡片），PBS 洗 3 min × 3 次。

4. 滴加 1:（5～20）正常羊血清或牛血清 20 min（室温或37℃），吸去多余血清，不洗。

5. 适当稀释的特异性一抗（例如来自种属 A）37℃ 孵育 60 min 或 4℃ 过夜，PBS 洗 3 × 3 min。

6. 第二抗体（也称桥抗体，抗种属 A 的 IgG 抗体）37℃ 孵育 40 min，PBS 洗 3 × 3 min。

7. 抗酶抗体（来自种属 A）37℃ 孵育 40 min，PBS 洗 3 × 3 min。

8. 酶（HRP 70～100 μg/ml，PBS 溶解）37℃ 孵育 40 min，PBS 洗 3 × 3 min。

9. 0.04% DAB + 0.03% H2O₂ 显色 8～12 min，最好在光镜下控制。

10. 充分水洗，苏木精复染，盐酸乙醇分化 15～30 s。

11. 常规树胶封片，结果观察。

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