三磷酸胶瞽酶钙―钴法

三磷酸胶瞽酶钙―钴法

  三磷酸腺苷酶 可水解磷酸与磷酸之间的高能键，而释放大量能量，而磷酸酶是酯酶 ，能水解磷酸与碳酸之间的键。反应式如下：

 

    A--P～P～P+H₂ O ATPase A―P―P+ H₃ PO₄ +能量

 

    在生物膜上，ATP酶的功能是参与离子泵的主动运输，因此细胞膜呈强阳性，ATP酶可作为肝细胞早期受损的敏感指标。此酶活性在心肌最高，其次为骨骼肌、肺、肾脏、脑和胰腺。由于各种ATP酶的最适pH值不同，故所用显示方法也不同。下面仅介绍显示Ca²⁺ ATPase的钙―钴法。

三磷酸腺苷酶钙―钴法类似碱性磷酸酶的钙―钴法，但底物改用三磷酸腺苷钠盐，最适pH 9．4，对ATP酶型Mg²⁺ 具有抑制作用。

 

    1．孵育液配制

    0．1mol/L巴比妥钠(pH 9．4)                2．0ml

    三磷酸腺苷二钠盐                          30mg

    蒸馏水                                    1．0ml

    0．18mol儿氯化钙                          1．0ml

    0．1mol/LNaOH调至pH 9．4，蒸馏水加至      10ml

 

    2．染色程序

    (1)新鲜组织冷丙酮固定30分钟，冰冻切片；

    (2)人孵育液(新鲜配制)37~C孵育3小时后蒸馏水漂洗；

    (3)1％CaCl₂ 溶液洗2分钟；

    (4)蒸馏水洗；

    (5)1％CaCl₂ 溶液洗2分钟；

    (6)流水洗；

    (7)人1％硫化铵1分钟；

    (8)流水洗；

    (9)干燥后梯度乙醇脱水，二甲苯透明；

    (10)甘油明胶封固。

 

    3．结果  酶活性处显示黑棕色。

 

    4．对照实验   ①用β―甘油磷酸钠代替ATP钠盐应为阴性；②孵育液中加入ι―四咪唑抑制碱性磷酸酶排除假阳性；③去底物。

 

    5．注意事项  此法要求Ca：―浓度在孵育前后不能降低，否则产生的磷酸根离子不能被完全捕获而影响准确定位。如染色效果不好可在孵育前将切片放入1％CaCl₂ 溶液中，37℃作用5分钟。

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