三磷酸胶瞽酶钙―钴法
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三磷酸胶瞽酶钙―钴法
A--P~P~P+H2
O ATPase
A―P―P+ H3
PO4
+能量
在生物膜上,ATP酶的功能是参与离子泵的主动运输,因此细胞膜呈强阳性,ATP酶可作为肝细胞早期受损的敏感指标。此酶活性在心肌最高,其次为骨骼肌、肺、肾脏、脑和胰腺。由于各种ATP酶的最适pH值不同,故所用显示方法也不同。下面仅介绍显示Ca2+
ATPase的钙―钴法。
三磷酸腺苷酶钙―钴法类似碱性磷酸酶的钙―钴法,但底物改用三磷酸腺苷钠盐,最适pH 9.4,对ATP酶型Mg2+
具有抑制作用。
1.孵育液配制
0.1mol/L巴比妥钠(pH 9.4) 2.0ml
三磷酸腺苷二钠盐 30mg
蒸馏水 1.0ml
0.18mol儿氯化钙 1.0ml
0.1mol/LNaOH调至pH 9.4,蒸馏水加至 10ml
2.染色程序
(1)新鲜组织冷丙酮固定30分钟,冰冻切片;
(2)人孵育液(新鲜配制)37~C孵育3小时后蒸馏水漂洗;
(3)1%CaCl2
溶液洗2分钟;
(4)蒸馏水洗;
(5)1%CaCl2
溶液洗2分钟;
(6)流水洗;
(7)人1%硫化铵1分钟;
(8)流水洗;
(9)干燥后梯度乙醇脱水,二甲苯透明;
(10)甘油明胶封固。
3.结果 酶活性处显示黑棕色。
4.对照实验
①用β―甘油磷酸钠代替ATP钠盐应为阴性;②孵育液中加入ι―四咪唑抑制碱性磷酸酶排除假阳性;③去底物。
5.注意事项 此法要求Ca:―浓度在孵育前后不能降低,否则产生的磷酸根离子不能被完全捕获而影响准确定位。如染色效果不好可在孵育前将切片放入1%CaCl2
溶液中,37℃作用5分钟。