明胶酶谱法

实验步骤

1.取对数期的癌细胞在的无血清培养基DMEM中培养24h。

2.次日收集上清液，将上清液移入离心管中 2000rpm 离心10min，-70℃储存备用。

3.根据细胞计数调整各组细胞培养上清液中的蛋白浓度（或者测定蛋白浓度调整使所上蛋白总量一致）。与5×上样缓冲液混合，13ul样本+4ul上样缓冲液。（不要用枪用力吹打，防止出现过多气泡）

4.配制分离胶和浓缩胶，16ul/孔上样（根据表达强度和蛋白浓度确定上样量），4℃进行SDS-PAGE 电泳100v约1.5小时（电泳时在周围敷上冰，有利于使条带跑直）。

5.电泳结束后,将凝胶置于洗脱液(2.5% Triton X-100，50mmol/L Tris -HCl ，5mmol/L CaCl2，pH7. 6) 中振荡洗脱2次,每次40分钟,然后用漂洗液(除不含Triton X - 100 外其余同洗脱液) 漂洗2次,每次20分钟,接着,将凝胶置于孵育液( 50mmol/L Tris - HCl , 5mmol/ CaCl2 , 0. 02% Brij-35 ,pH7.6) 中37℃ 孵育42h。

6.孵育结束后经染色液(0.05% Coomassic 亮蓝、30%甲醇、10%乙酸) 染色3h,及脱色液A、B、C(甲醇浓度分别为30%、20%、10 % ,乙酸浓度分别为10 %、10 %、5%) 分别脱色0.5、1、2h后，显示出MMP-2（72KD） 和MMP -9（92 KD）为位于蓝色背景上的透亮带，用凝胶图像分析系统分析读取条带面积，宽度和灰度值，做统计分析。

注意事项：

1.制备聚丙烯酰胺时应注意排除气泡 。

2.明胶酶谱的活性受钙离子，锌离子，和PH值等因素的影响，因此缓冲液 配制应严格准确，尽量用超纯水，孵育温度也掌握好。

3.用大梳子

4.孵育液的PH最好在7.5-7.6，复性的TRITON时间长了会有絮状物，所以实验时尽量使用新鲜配置的。

5.孵育的37度不要在CO2培养箱中，因为会改变孵育液的PH值，在普通孵箱即可。

6.明胶要4度保存，配好后1周内使用

酶谱法的基本过程是先将样品进行SDS-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE，含0.1%明胶）电泳分离，然后在有二价金属离子存在的缓冲系统中使样品中的MMP-2和MMP-9恢复活性，在各自的迁移位置水解凝胶里的明胶，最后用考马斯亮蓝将凝胶染色，再脱色，在蓝色背景下可出现白色条带，条带的强弱与MMP-2和MMP-9活性成正比。

供参考的操作方案和注意事项：

1. 收集生长对数期的癌细胞培养液。

2. 将500μl培养液，45μl明胶琼脂糖颗粒（使用前混匀）和45μl平衡缓冲液混合均匀后加入微型旋转柱中，于旋转混合仪上平衡30min。

3. 用洗涤缓冲液1洗涤琼脂糖颗粒，每次100μl洗涤3次，7000r/min离心除去洗涤缓冲液1。

4. 用100μl洗涤缓冲液2洗涤琼脂糖颗粒1次，7000r/min离心除去洗涤缓冲液2。

5. 向微型旋转柱中加入40μl的2x上样缓冲液，7000r/min离心。将离心后的上样缓冲液重新加入微型旋转柱中，于12000r/min离心10s。

6. 采用8%分离胶在130V恒压下电泳2.5h。

7. 用洗脱液在摇床上洗涤蛋白胶2次，各30min，除去胶中的SDS。

8. 37℃孵育蛋白胶24h，使MMP分解明胶。

9. 摇床上染色1h及脱色至条带清晰。

10. 蛋白成像：用凝胶成像仪进行拍照。