明胶酶谱法

细胞外基质（ECM）是细胞生存的重要内环境，不仅含有胶原、糖蛋白、蛋白多糖等成分，而且含有大量的蛋白酶、细胞因子、黏附分子。ECM，尤其是其中的基底膜，是肿瘤转移过程中必须克服的生理屏障。基质金属蛋白酶家族（MMPs）可以降解细胞外基质，帮助肿瘤细胞克服这一屏障

并为细胞增殖提供空间。MMP2、MMP9是主要降解基底膜上IV型胶原和明胶的基质金属蛋白酶类，与恶性肿瘤浸润转移的关系尤为密切，通过蛋白电泳即可检测MMP2，MMP9的活性。

一、主要试剂的配制

1. 平衡缓冲液：50 mmol／L Tris（pH7.5），0.5 mol／L NaCl，10 mmol／L

CaCl₂，0.01％Tween 20，5 mmol／L 邻二氮菲。

2. 洗涤缓冲液1：50 mol／L Tris（pH7.5），0.5 mmoL／L NaCl，10 mmol／L CaCl₂，0.05％Tween 20，5 mmol／L邻二氮菲。

3. 洗涤缓冲液2：50 mmol／L Tris（pH7.5），10 mmoL／L CaCl2，0.01％Tween 20，5 mmol／L邻二氮菲。

4. 8％分离胶（含0.1％明胶）：30％丙烯酰胺2.7 ml，ddH20 4.5 ml，1.5 mol／L Tris（pH 8.8）2.5 ml，10％ SDS 100 μl，10％ 过硫酸铵（APS） 100 μl，TEMED 6 μl。

5. 浓缩胶：ddH20 2.1 ml，30％丙烯酰胺0.5 ml，1 mol／L Tris-HCI（pH6.8）0.38 ml，10％SDS 30 μl，10％过硫酸铵30 μl，TEMED 3 μl。

6. 5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液（pH8.3）：0.125 mol／L Tris-HCl，1.25 mol／L甘氨酸，0.5％SDS。

7. 5×上样缓冲液：30％ 1 mol／L Tris-HCl（pH6.8），25％甘油，0.05％溴酚蓝。

8. 洗脱液：2.5％ TritonX-100（去离子水定容）。

9. 孵育液：50 mmoL／L Tris-HCl，10 mmol／L CaCl₂，1％ TritonX-100，

pH7.5，去离子水定容。

10. 染色液：0.25％考马斯亮蓝R-250，45％甲醇，10％乙酸。

11. 脱色液：30％甲醇，10％乙酸。

二、实验方法

1. 收集生长对数期的癌细胞培养液。

2. 将500μl培养液，45μl明胶琼脂糖颗粒（使用前混匀）和45μl平衡缓冲液混合均匀后加入微型旋转柱中，于旋转混合仪上平衡30min。

3. 用洗涤缓冲液1洗涤琼脂糖颗粒，每次100μl洗涤3次，7000r/min离心除去洗涤缓冲液1。

4. 用100μl洗涤缓冲液2洗涤琼脂糖颗粒1次，7000r/min离心除去洗涤缓冲液2。

5. 向微型旋转柱中加入40μl的2x上样缓冲液，7000r/min离心。将离心后的上样缓冲液重新加入微型旋转柱中，于12000r/min离心10s。

6. 采用8%分离胶在130V恒压下电泳2.5h。

7. 用洗脱液在摇床上洗涤蛋白胶2次，各30min，除去胶中的SDS。

8. 37℃孵育蛋白胶24h，使MMP分解明胶。

9. 摇床上染色1h及脱色至条带清晰。

10. 蛋白成像：用凝胶成像仪进行拍照。

1. 制备聚丙烯酰胺时应注意排除气泡。

2. 明胶酶谱的活性受钙离子，锌离子和pH值等因素的影响，因此缓冲液配制应严格准确，尽量用超纯水，孵育温度要控制好。

3. 为防止样品中的酶变性失活，禁忌煮沸蛋白样品，且上样缓冲液中不能含β-巯基乙醇或DTT。

4. 孵育液的pH最好在7.5——7.6，复性的Triton放置时间过长会有絮状物，所以实验时尽量使用新鲜配置的溶液。

5. 孵育的37℃不要在CO₂培养箱中，因为会改变孵育液的pH值，在普通孵箱即可。

6. 明胶要4℃保存，配好后1周内使用。