明胶酶谱法操作

 

明胶酶谱法

原理： 

试剂的配制
（1）配制10%SDS聚丙烯酰胺凝胶（含1.0mg/ml 明胶，配好后1周内使用，明胶含量低灵敏度高）
A．分离胶的配制（注：根据你所用的电泳仪胶的大小确定配制胶的量）
10% SDS聚丙烯酰胺凝胶 10ml（包括）
ddH2O                                                                      4.5ml
30%储备胶（0.8%BIS+29.2%丙烯酰胺）              2ml
1.5mol/l Tris（PH 8.8）                                  2.5ml
10% SDS                                                                 100ul
10%过硫酸铵（APS）                                            100ul
TEMED                                                                          8ul
1%明胶（1g明胶-->100ml，37°C水浴溶解） 0.5ml

B.浓缩胶的配制
浓缩胶                                                                        6ml
ddH2O                                                                      4.5ml
30%储备胶                                                            0.75ml
1mol/l Tris-HCL( PH 6.8)                              0.76ml
10% SDS                                                                   60ul
10%过硫酸铵                                                            60ul
TEMED                                                                         6ul

（3）5×Tris �甘氨酸电极缓冲液
0.125mol/l Tris-HCL，1.25mol/l 甘氨酸，0.5%SDS（PH 8.3）

（4）4 ×上样缓冲液
0.32% Tris-HCL 6.4ml
4%SDS（PH7.2） 8ml
16%甘油 3.2 ml
溴酚蓝 0.024g
ddH2O 2.4ml
(5)  洗脱液:2.5% Triton X-100，50mmol/L Tris-HCl<6.057g/L> ，5mmol/L CaCl2<0.5549g/L>，pH7. 6      （40分钟两次，中间换液）

（6）漂洗液：  50mmol/L Tris-HCl， 5mmol/L CaCl2，pH7. 6 （20分钟2次）
（7）孵育液：50mmol/LTris,pH7.5,150mmol/LNaCl,10mmol/LCaCl2,0.02%NaN3（孵育42小时）
（8）染色液：0.05% Coomassic 亮蓝 R-250，30%甲醇，10%乙酸（染色3小时）
（9）脱色液A、B、C：甲醇浓度分别为30%、20%、10 % ,乙酸浓度分别为10 %、10 %、5% （分别30min、1h、2h脱色）

实验步骤
1.取对数期的癌细胞在的无血清培养基DMEM中培养24h。
2.次日收集上清液，将上清液移入离心管中 2000rpm 离心10min，-70℃储存备用。
3.根据细胞计数调整各组细胞培养上清液中的蛋白浓度（或者测定蛋白浓度调整使所上蛋白总量一致）。与5×上样缓冲液混合，13ul样本+4ul上样缓冲液。（不要用枪用力吹打，防止出现过多气泡）
4.配制分离胶和浓缩胶，16ul/孔上样（根据表达强度和蛋白浓度确定上样量），4℃进行SDS-PAGE 电泳100v约1.5小时（电泳时在周围敷上冰，有利于使条带跑直）。
5.电泳结束后,将凝胶置于洗脱液(2.5% Triton X-100，50mmol/L Tris -HCl ，5mmol/L CaCl2，pH7. 6) 中振荡洗脱2次,每次40分钟,然后用漂洗液(除不含Triton X - 100 外其余同洗脱液) 漂洗2次,每次20分钟,接着,将凝胶置于孵育液( 50mmol/L Tris - HCl , 5mmol/ CaCl2 , 0. 02% Brij-35 ,pH7.6) 中37℃ 孵育42h。
6.孵育结束后经染色液(0.05% Coomassic 亮蓝、30%甲醇、10%乙酸) 染色3h,及脱色液A、B、C(甲醇浓度分别为30%、20%、10 % ,乙酸浓度分别为10 %、10 %、5%) 分别脱色0.5、1、2h后，显示出MMP-2（72KD） 和MMP -9（92 KD）为位于蓝色背景上的透亮带，用凝胶图像分析系统分析读取条带面积，宽度和灰度值，做统计分析。

注意事项：
1.制备聚丙烯酰胺时应注意排除气泡 。
2.明胶酶谱的活性受钙离子，锌离子，和PH值等因素的影响，因此缓冲液 配制应严格准确，尽量用超纯水，孵育温度也掌握好。

3.用大梳子

4.孵育液的PH最好在7.5-7.6，复性的TRITON时间长了会有絮状物，所以实验时尽量使用新鲜配置的。

5.孵育的37度不要在CO2培养箱中，因为会改变孵育液的PH值，在普通孵箱即可。

6.明胶要4度保存，配好后1周内使用

 

凝胶制备：

1.玻璃板对齐后放入夹中，垂直卡紧，加满水检漏。

2.配10%分离胶，APS和TEMED作用为促凝，最后灌胶前加。若板不漏水，则将水倒出，并用吸水纸洗净后灌胶，灌至大约3/4处，上面加满水压平。

3.配浓缩胶，同样地，APS和TEMED最后加，分离胶灌入约30min后观察小烧杯中剩余分离胶是否已凝，同时仔细观察可见玻板水和胶间有一条折线，说明胶已凝固。

4.将上面的水倒去，吸水纸洗净，灌入浓缩胶，灌满，注意一定不要有气泡，然后将梳子插入，注意保持水平，约30min后凝固可用。

5.拔梳子在电泳缓冲液中拔，加样孔用小针筒冲洗干净再上样，注意上样时勿使样品逸至邻孔，样品混匀时要轻，不要产生气泡，否则加样时易导致逸出而使结果不准确。