原理
PPO催化各种酚与O2氧化为醌。本实验是采用邻苯二酚为底物，在0.2M磷酸氢二钠－0.1M柠檬酸缓冲液PH5.8的反应体系中，PPO催化邻苯二酚形成褐色的醌，在分光光度计410nm处使反应体系的OD值产生变化，通过OD值上升的读数变化确定PPO的酶活大小。
材料与仪器
多酚氧化酶粗酶液
邻苯二酚溶液 柠檬酸缓冲液 邻酸二氢钠 硫酸铵沉淀组分 DE-52洗脱组分 葡聚糖凝胶洗脱组分
试管 恒温水浴 分光光度计
邻苯二酚溶液 柠檬酸缓冲液 邻酸二氢钠 硫酸铵沉淀组分 DE-52洗脱组分 葡聚糖凝胶洗脱组分
试管 恒温水浴 分光光度计
步骤
在含有4mlPH5.8的0.2M磷酸氢二钠－0.1M柠檬酸缓冲液试管中加入0.05ml0.05M邻苯二酚溶液，在30℃恒温水浴中预热后加入0.05ml酶液，反应5分钟，在分光光度计410nm处读取吸光值。在上述条件下，以A410读数，以每分钟增加0.01O.D.值定义为一个酶活性单位（U）。
注意事项
1.反应混合液必须现配现用，否则会因邻苯二酚自动氧化而失效；
2.加样时，先加缓冲溶液，再加底物邻苯二酚，摇匀，在测量之前最后加酶提取液。
3.在试验中加入一种酚结合剂--聚乙烯吡咯烷酮（PVPP），它能与酚类化合物强烈地发生缔合作用，从而消去酶反应体系中的底物，使 PPO活性的测定更接近其真值
常见问题
PPO与抗病性的关系人们已进行了广泛的研究。植物在抵御病原微生物的侵染过程中，抗性相关酶发挥了重要作用，这主要包括了酚类代谢系统中的一些酶和病原相关蛋白家族PPO通过催化木质素及醌类化合物形成，构成保护性屏蔽而使细胞免受病菌的侵害，也可以通过形成醌类物质直接发挥抗病作用。由于自然界中存在着大量结构不同的多酚类物质，而催化这些酚类物质氧化的多酚氧化酶也是不同的。如果从微生物中筛选出有效的酶源或者利用酶修饰、基因异源表达和基因工程菌的构建等技术创造出有效的微生物酶源，这将着深远意义。
来源：丁香实验
