叶绿体色素含量的测定――分光光度法

叶绿体色素溶液各组成成分在可见光谱中具有不同的特征吸收峰。因此，应用分光光度计在某一特定波长下所测定的吸光度，根据经验公式即可计算出色素溶液中各色素浓度，不同溶剂所提取的色素吸收光谱有差异，因此，应使用不同的计算公式。

叶绿体色素的提取常用丙酮和乙醇有机溶剂。叶绿体色素 80 ％丙酮提取液中叶绿素 a 和 b 及类胡萝卜素分别在 663nm 、 646nm 和 470nm 波长下有最大吸收峰，而 95 ％乙醇提取液中它们则在 665nm 石 49nm 和 470nm 波长下具有最大吸收峰。

据此所测得的吸光度值代人不同的经验公式（见结果计算），计算出叶绿体色素丙酮（或乙醇）提取液中叶绿素 a 和 b 的浓度及其叶绿素总浓度和类胡萝卜素的总浓度，并依据所使用的单位植物组织（鲜重、干重或面积），求算出色素的含量。

[ 实验目的 ]

掌握分光光度法对植物叶绿体色素提取液中叶绿素 a 和 b 的浓度及其叶绿素总浓度和类胡萝卜素的总浓度测定与计算方法，以及植物材料中各种色素含量的求算方法。

[ 器材和试剂 ]

1 ．植物材料 新鲜（或烘干）植物叶片，如菠菜叶片等。

2 ．实验器材 分光光度计、天平、研钵、剪刀、漏斗、滤纸、棕色容量瓶、吸水纸、擦镜纸和滴管。

3 ．实验试剂 80 ％丙酮（或 95 ％乙醇）、石英砂和碳酸钙粉。

[ 操作步骤］

1 ．色素的提取

①称取新鲜（或干材料）的洗净擦于的植物叶片 0.5g （或一定面积），去中脉、剪碎后放入研钵中，加少量石英砂和碳酸钙粉及 2~3ml80 ％丙酮（或 95 ％乙醇），冰浴中研磨至组织变白，再加丙酮 10ml ，研成匀浆，暗处静置约 10min 。

②将提取液过滤到 50 ml 棕色容量瓶中，用丙酮反复冲洗研体与研棒数次并用少量丙酮反复冲洗滤纸和残渣，直至无绿色为止，以使色素全部转移入容量瓶。最后用丙酮定容至 50 ml ，摇匀，并保存于暗处备用待测。每一材料要做 3 ～ 5 份，重复提取测定，以期获得准确的色素含量值。

2 ．吸光度的测定

①将色素提取液重新混匀。

②取光径 1cm 的比色杯，注入上述色素丙酮提取液，以 80 ％丙酮注入另一同样的比色杯内作为空白对照，在波长 663 、 646 和 470nm 下测定吸光度。

3 ．结果计算

分别计算出叶绿素 a 上的浓度及其叶绿素总浓度和类胡萝卜素的浓度。

[ 注意事项］

1 ．光对叶绿素有破坏作用，实验操作应在弱光下进行，且应尽量在短时间内研磨。

2 ．色素提取液若混有其他物质而造成浑浊，将影响吸光度的测定，应重新过滤或离心。

3 ．色素吸光度测定前，应按仪器说明及标准叶绿素 a 、 b 对分光光度计的波长进行校正，否则影印叶绿素含量的测定精度。

[ 思考题］

1 叶绿素 a 和 b 在红光和蓝光区都有吸收峰，可否在蓝光区的吸收峰波长下进行叶绿素 a 和 b 的定量分析，原因何在？

2 解释用分光光度法测定叶绿素含量时首先标定仪器波长精确度的原因，试比较仪器标定与未标定的测定结果的误差。

[ 探索性实验 ]

应用已掌握的植物叶绿体色素的提取、分离和含量测定的实验技术与方法，取 植物和 植物（或阴生植物和阳生植物）的长成叶片，以 95 ％乙醇提取叶绿体色素，根据下表所涉及的若干问，设计实验，完成下表，并回答问题。